식품의약품안전처 고시 제2016-29호

건강기능식품의 기준 및 규격

일부개정고시

2016. 4. 20.

식품의약품안전처

식품의약품안전처 공고 제2016-29호

「건강기능식품의 기준 및 규격」일부 개정고시

1. 개정 이유
｢건강기능식품의 기준 및 규격｣의 시험법을 효율적으로 개정하여 영업자 및 관계공무원의 이해를 도모하고, 건강기능식품의 기준 및 규격 적용을   합리화하고자 함

2. 주요 내용

가. 건강기능식품 시험법 추가 및 개선

1) 분석 결과의 효율성을 높이기 위하여 시험법 개정

2) 비타민 C, 아스타잔틴, 진세노사이드 시험법 추가 및 코엔자임Q10,  유산간균 및 구균, 비피더스균, 플라보놀배당체 시험법 개선

3) 초산에틸, 비타민 A, 나이아신, 엽산, 비타민 B12, 비타민 C 시험법의 단위 표기 및 분석 장비 등 명확화

4) 비타민 D, 비타민 E, 비타민 K, 칼슘, 식이섬유, 인지질 중 포스파티딜콜린의 함량, 콜레스테롤, 식물스테롤 시험법 중 올바른 맞춤법과 외래어 표기법에 따른 용어 수정

나. 건강기능식품의 보존 및 유통기준 관련 규정 재정비

1) 건강기능식품 원료‧제품 소분 관련 제도 개선을 위해 상위법령에   근거가 마련됨에 따라 관련 규정 삭제

2) 건강기능식품에 관한 법률 시행규칙 제12조(영업자의 준수사항)  〔별표4〕 너목 신설

3. 기타 참고사항

가. 관계법령 : ｢건강기능식품에 관한 법률｣

나. 예산조치 : 별도조치 필요 없음

다. 합    의 : 해당 사항 없음

라. 기    타

1) 행정예고(공고 제2016-48호, 2016. 2. 5. ～ 2016. 4. 4.)

2) 건강기능식품심의위원회 심의

- 기능성원료·성분 인정 및 기준·규격분과(2016. 4. 8.)

3) 규제심사

- 비규제 확인(2016. 1. 25)

식품의약품안전처 고시 제2016-   호

｢건강기능식품에 관한 법률｣ 제14조 및 제15조에 따른 ｢건강기능식품의 기준 및 규격｣(식품의약품안전처 고시 제2014-204호, 2014.12.30)을 다음과   같이 개정합니다.

2016년 월 일

식품의약품안전처장

건강기능식품의 기준 및 규격 일부개정고시(안)

건강기능식품의 기준 및 규격 일부를 다음과 같이 개정한다.

제 2. 5. 9)를 삭제하고, 제 2. 5. 10) 제 2. 5. 11) 및 2. 5. 12)를 각각 제 2. 5. 9), 제 2. 5. 10) 제 2. 5. 11)로 한다.

제 4. 2. 2-5 2-5-5 4. 4.1 4.1.1 중 “1.00 mL”을 “1 g”으로 하며, 4.1.3   “ppm”을 “μg/mL”으로, 4.2.3 “1, 2, 5 ppm”을 “5, 10, 20 μg/mL”으로 한다.

제 4. 3. 3-1 3-1-1 2. 2.1 2.1.2 중 “분액깔때기”를 “갈색분액깔때기”로 한다.

제 4. 3. 3-1 3-1-1 4. 4.2. 4.2.8 중 “분액깔때기”를 “갈색분액깔때기”로 한다.

제 4. 3. 3-1 3-1-1 4. 4.2. 4.2.9 중 “분액깔때기”를 “갈색분액깔때기”로 한다.

제 4. 3. 3-1 3-1-1 4. 4.2. 4.2.12 중 “분액깔때기”를 “갈색분액깔때기”로 한다.

제 4. 3. 3-1 3-1-2 2. 2.1. 2.1.5 중 “분액깔때기”를 “갈색분액깔때기”로 한다.

제 4. 3. 3-1 3-1-2 4. 4.3. 4.3.3 중 “분액깔때기”를 “갈색분액깔때기”로 한다.

제 4. 3. 3-1 3-1-2 4. 4.3. 4.3.4 중 “분액깔때기”를 “갈색분액깔때기”로 한다.

제 4. 3. 3-1 3-1-2 4. 4.3. 4.3.5 중 “분액깔때기”를 “갈색분액깔때기”로 한다.

제 4. 3. 3-1 3-1-2 4. 4.3. 4.3.8 중 “분액깔때기”를 “갈색분액깔때기”로 한다.

제 4. 3. 3-3 4. 4.3. 4.3.6 중 “분액깔대기”를 “분액깔때기”로 한다.

제 4. 3. 3-4 3-4-2 4. 4.3, 4.3.8 중 “분액깔대기”를 “분액깔때기”로 한다.

제 4. 3. 3-5 3-5-2 2. 2.1 2.1.5 중 “분액깔대기”를 “분액깔때기”로 하고, “2.1.7”을 “2.1.6”으로 “2.1.8”을 “2.1.7”로, “2.1.9”를 “2.1.8”로 한다.

제 4. 3. 3-8 3-8-3 1. 중 “니코틴산(나이아신)”을 “나이아신(니코틴산과 니코틴산아미드)”로 하고, 제 4. 3. 3-8 3-8-3 3. 3.1.2를 다음과 같이 신설한다.

3.1.2 Nicotinamide(Pyridine-3-carboxamide)

분자식 : C6H6N2O, 분자량 : 122.13, CAS No. : 98-92-0

제 4. 3. 3-8 3-8-3 5. 5.2. 5.2.1 중 “니코틴산”을 “나이아신”으로, “C : 시험용액 중의 니코틴산의 농도(μg/mL)”를 “C : 시험용액 중의 니코틴산 및 니코틴산 아미드 농도의 합(μg/mL)”으로 한다.

제 4. 3. 3-11 3-11-2 2. 2.3 중 “A용액(5 mM sodium hexanesulfonate /0.1% 초산 용액), B용액(5 mM sodium hexanesulfonate/0.1% 초산 용액: 메탄올(70:30))”을 “A용액(5 mM Tetrabutyl ammonium bromide 용액), 아세토니트릴”로 한다.

제 4. 3. 3-12 3-12-2 1. 중 “존재하는 비타민B12을 옥타데실화한 칼럼으로 피리독신염산염을 분리하는 방법으로 비타민B12의 측정파장 550 nm에서 검출하여  정량한다.”를 “비타민B12을 이동상으로 추출하고 액체크로마토그래프(육방전환밸브시스템)/자외부흡광광도검출기를 이용하여 분석하는 방법으로 최대흡수파장인 550 nm에서 정량분석 한다.”로 한다.

제 4. 3. 3-12 3-12-2 2. 2.2. 2.2.3 중 “Capcellpak MF C8 (안지름 4.6 mm, 길이 150 mm, 충진입자 크기 5 μm) 또는 이와 동등한 것”을 “육방전환밸브시스템”으로 하고, 2.2.4 중 “Capcellpak MG C18 (안지름 2.0 mm, 길이 35 mm, 충진입자 크기 5 μm) 또는 이와 동등한 것”을 “전처리 컬럼 : Capcellpak MF C8 (안지름 4.6 mm, 길이 150 mm, 충진입자 크기 5 μm) 또는 이와 동등한 것”으로, 2.2.5 중 “Capcellpak UG C18 (안지름 1.5 mm, 길이 250 mm, 충진입자 크기 5 μm) 또는 이와 동등한 것”을 “농축 컬럼 : Capcellpak MG C18 (안지름 2.0 mm, 길이 35 mm, 충진입자 크기 5 μm) 또는 이와 동등한 것”으로 한다.

제 4. 3. 3-12 3-12-2 2. 2.2. 2.2.6을 다음과 같이 신설한다.

2.2.6 분석 컬럼 : Capcellpak UG C18 (안지름 1.5 mm, 길이 250 mm, 충진입자 크기 5 μm) 또는 이와 동등한 것

제 4. 3. 3-12 3-12-2 2. 2.3을 다음과 같이 한다.

2.3 분석장비의 준비

이동상은 5 mM 인산이수소칼륨(KH2PO4) 용액과 5 mM 인산이수소칼륨(KH2PO4) 용액 : 메탄올(80:20)을 이용하여 전처리칼럼은 분당 500 μL,  분석칼럼은 분당 120 μL를 충분한 시간동안 흘려 안정화시킨다.

제 4. 3. 3-12 3-12-2 5. 5.1 표 1. 중 주입량 조건인 주입량 “10 μL”을 “200 μL”로 하고, 이동상 조건인 “5 mM KH2PO4/Methanol (80/20)”을 “전처리컬럼 : 5mM 인산이수소칼륨(KH2PO4) 용액, 분석컬럼 : 5 mM 인산이수소칼륨(KH2PO4) 용액 /메탄올(MeOH)(80:20)”로 하고, 유량의 조건인 “유량 120 μL/분”을 “전처리칼럼 : 500 μL/분, 분석칼럼 : 120 μL/분”으로 한다.

제 4. 3. 3-14 3-14-3 5. 5.2. 5.2.3을 다음과 같이 한다.

5.2.3 계산식

비타민 C(mg/100 g) =	S ×	a×b	×	100
		검체량(g)		1000

S : 시험용액 중의 아스코르빈산의 농도(μg/mL)

a : 시험용액의 전량(mL)

b : 시험용액의 희석배수

제 4. 3. 3-14 3-14-4를 다음과 같이 신설한다.

3-14-4 비타민 C(제4법)

1. 시험방법의 요약

본 시험법은 시료 중 존재하는 아스코르빈산팔미테이트를 메탄올로 균질화시킨 후 옥타데실화된 칼럼을 연결하여 분리하는 방법으로 자외부흡광 광도검출기를 이용하여 최대 흡수 파장인 245 nm에서 검출하여 정량한다.

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 용매용 일회용 실린지

2.1.2 여과용 멤브레인 필터 및 디스크형 멤브레인 필터

2.1.3 가지달린 삼각플라스크(Filter flask)

2.1.4 여지(Filter paper)

2.1.5 액체크로마토그래프용 유리병

2.1.6 부피플라스크

2.1.7 원심분리관

2.2 분석장비

2.2.1 고속액체크로마토그래프

2.2.2 자외부흡광광도검출기

2.2.3 옥타데실실릴화한 칼럼(안지름 4.6 mm, 길이 150 mm, 충전제 : octadecyl silica) 또는 이와 동등한 것

2.3 분석장비의 준비

이동상은 2개의 용매가 사용되는데 0.05 M KH2PO4 : 아세토니트릴(30 : 70) 이 두 개의 용매를 분당 1 mL씩 충분한 시간동안 흘려 기기와 칼럼을 안정화시킨다.

3. 표준물질 및 일반시약

3.1 표준물질

3.1.1  Ascorbyl palmitate
분자식 : C22H38O7, 분자량 : 414.53, CAS No. : 137-66-6

3.2 일반시약

3.2.1 메탄올(Methanol)

3.2.2 아세토니트릴(Acetonitrile)

3.2.3 증류수(Distilled water)

3.2.4 인산칼륨(Potassium phosphate)

4. 시험과정

4.1 표준용액 제조

4.1.1 표준원액

아스코르빈산팔미테이트 10 mg을 정밀히 달아, 메탄올에 녹여 100 mL로 한 것을 표준원액으로 한다.

4.1.2 표준용액

필요한 경우 표준원액에 메탄올을 넣어 원하는 농도로 희석하여 사용한다. 사용 시 조제한다.

4.2 시험용액 제조

4.2.1 아스코르빈산팔미테이트 약  5 mg에 해당하는 시료를 10 mL 메탄올을 가하여 10분간 현탁시킨 후 적당량의 메탄올을 넣어 균질화한다.

4.2.2 균질화된 시료를 100 mL 메스플라스크에 옮기고 소량의 메탄올로 용기를 씻은 후 메스플라스크에 합하여 100 mL로 한다.

4.2.3 3,000 rpm에서 10～15분간 원심분리를 행하여 상등액을 취하고 메탄올로 적당히 희석하여 시험용액으로 한다.

5. 분석 및 계산

5.1 기기분석

항목	조건
주입량	10 μL
칼럼온도	실온
이동상	0.05 M KH2PO4 : 아세토니트릴(30 : 70)
검출기 파장	245 nm
유량	1 mL/min

표 1. 고속액체크로마토그래프 조건(예)

5.2 정량시험

5.2.1 시험용액 및 표준용액을 각각 10 μL씩 주입하여 얻은 피크의 넓이 또는 높이를 구하여 검량선을 작성한 후 시험용액의 아스코르빈산팔미테이트의 농도를 구한다.

5.2.2 계산식에 의해 시료 중 아스코르빈산의 함량을 산출한다.

비타민 C (mg/100 g)	=	S ×	a × b	×	100	×	0.4249
			검체량(g)		1,000

5.2.3 계산식

S : 시험용액 중의 아스코르빈산팔미테이트의 농도(μg/mL)

a : 시험용액의 전량(mL)

b : 시험용액의 희석배수

0.4249 : 아스코르빈산팔미테이트의 아스코르빈산으로의 환산계수

제 4. 3. 3-16 3-16-3 “칼슘(제3법 원자흡광광도법)”을 “칼슘(제3법 유도결합 플라즈마법)으로 한다.

제 4. 3. 3-26 3-26-1 2. 2.1. 2.1.1 중 “비이커”를 “비커”로 한다.

제 4. 3. 3-26 3-26-1 4. 4.1. 4.1.2 중 “비이커”를 “비커”로 한다.

제 4. 3. 3-26 3-26-1 4. 4.2. 4.2.1 중 “비이커”를 “비커”로 한다.

제 4. 3. 3-26 3-26-1 4. 4.3. 4.3.1 중 “비이커”를 “비커”로 한다.

제 4. 3. 3-26 3-26-1 4. 4.4. 4.4.1 중 “비이커”를 “비커”로 한다.

제 4. 3. 3-26 3-26-2 2. 2.1. 2.1.2 중 “비이커”를 “비커”로 한다.

제 4. 3. 3-26 3-26-2 2. 2.1. 2.1.10 중 “비이커”를 “비커”로 한다.

제 4. 3. 3-26 3-26-2 3. 3.3. 3.3.5 중 “비이커”를 “비커”로 한다.

제 4. 3. 3-26 3-26-2 3. 3.3. 3.3.6 중 “비이커”를 “비커”로 한다.

제 4. 3. 3-26 3-26-2 4. 4.2. 4.2.1 중 “비이커”를 “비커”로 한다.

제 4. 3. 3-26 3-26-2 4. 4.3. 4.3.1 중 “비이커”를 “비커”로 한다.

제 4. 3. 3-34 3-34-1 2. 2.1. 2.1.4 중 “비이커”를 “비커”로 한다.

제 4. 3. 3-34 3-34-1 4. 4.3 4.3.4 중 “비이커”를 “비커”로 한다.

제 4. 3. 3-34 3-34-1 4. 4.4 4.4.1 중 “비이커”를 “비커”로 한다.

제 4. 3. 3-34 3-34-2 2. 2.1 2.1.4 중 “비이커”를 “비커”로 한다.

제 4. 3. 3-34 3-34-2 2. 2.1 2.1.5 중 “비이커”를 “비커”로 한다.

제4. 3. 3-34 3-34-2 4. 4.3 4.3.4 중 “비이커”를 “비커”로 한다.

제 4. 3. 3-34 3-34-2 4. 4.4. 4.4.1 중 “비이커”를 “비커”로 한다.

제 4. 3. 3-35 4. 4.2 4.2.2 4.2.2.5 중 “깔대기”를 “깔때기”로 한다.

제 4. 3. 3-38 4. 4.2 4.2.2 4.2.2.5 중 “깔대기”를 “깔때기”로 한다.

제 4. 3. “3-46 아스타잔틴”을 “3-46 아스타잔틴 3-46-1 아스타잔틴(제1법)”으로 한다.

제 4. 3. 3-46 3-46-2 아스타잔틴(제2법)을 다음과 같이 신설한다.

3-46-2 아스타잔틴(제2법)

1. 시험방법의 요약

본 시험법은 시료 중 아스타잔틴을 아세톤으로 녹여 추출하고 cholesterol esterase를 넣어 아스타잔틴에 붙어있는 ester기를 분리시킨 후 정제하여 이동상으로 녹인 용액을 액체크로마토그래피/자외부흡광광도검출기 및 순상컬럼을 이용하여 분석하는 방법으로 최대 흡수파장인 474 nm에서 정량분석 한다.

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 갈색부피플라스크(100 mL)

2.1.2 액체크로마토그래프용 유리병

2.1.3 용매용 일회용 실린지

2.1.4 여과용 멤브레인필터 및 디스크형 멤브레인 필터

2.1.5 원심분리기

2.1.6 원심분리관(50 mL)

2.1.7 시험관(50 mL)(사용되는 초자는 갈색의 유리기구를 사용한다)

2.1.8 초음파진탕기

2.1.9 수욕조

2.1.10 질소농축기

2.1.11 질소가스

2.2 분석장비

2.2.1 자외분광광도계(UV/Visible Spectrophotometer)

2.2.2 고속액체크로마토그래피

2.2.3 자외부흡광광도 검출기(UV Detector) 또는 포토다이오드어레이 검출기(Photodiode array)

2.2.4 칼럼오븐

2.2.5 Luna silica 칼럼(안지름 4.6 mm, 길이 150 mm, 충진 입자 크기 3μm) 또는 이와 동등한 것

2.3 분석장비의 준비

이동상인 헥산과 아세톤을 82 : 18로 분당 1.2 mL씩 충분한 시간  동안 흘려 칼럼과 기기를 안정화 시킨다.

3. 표준물질 및 시약

3.1 표준물질

3.1.1 아스타잔틴(Astaxanthin)

분자식 : C40H52O4, 분자량 : 596.84, CAS No. : 19044-06-5

3.2 일반시약

3.2.1. 헥산(Hexane)

3.2.2. 클로로포름(Chloroform)

3.2.3. 아세톤(Acetone)

3.2.4. 석유 에테르(Petroleum ether)

3.2.5. 50 mM Tris-HCl 완충액(pH 7.0)

3.2.6. 무수황산나트륨(Sodium sulfate Anhydrous)

3.2.7. Cholesterol esterase

4. 시험과정

4.1 Cholesterol esterase 용액의 조제(사용직전에 조제)

4.1.1 Cholesterol esterase가 4 unit/mL(1 unit : pH 7.0, 37℃에서 1분당 1 μmole 콜레스테롤을 만드는데 필요한 효소의 양)이 되도록 50 mM Tris-HCl 완충액(pH 7.0)에 용해시킨다.

4.2. 표준원액의 조제

4.2.1. 아스타잔틴 표준품 3 mg을 100 mL 갈색부피플라스크에 정밀히 취한다.

4.2.2. 클로로포름 10 mL을 넣고 녹인다.

4.2.3. 헥산으로 표선까지 맞춘다.

4.3. 표준용액 조제

4.3.1. 100 mL 갈색부피플라스크에 표준원액 5, 10, 15 mL을 정밀히  취한다.

4.3.2. 클로로포름 4 mL을 넣어 녹인다.

4.3.3. 헥산으로 표선까지 맞춘다.

4.3.4. 4.3.3용액의 헥산을 대조액으로 하여 474 nm에서 흡광도를 측정한다.

4.3.5. 4.3.3용액을 표준용액으로 하여 고속액체크로마토그래피로 분석한다.

4.4. 시험용액 조제

4.4.1. 시료(아스타잔틴으로서) 약 1.5 mg을 100 mL 갈색부피플라스크에 정밀히 취한다.

4.4.2. 아세톤 100 mL을 넣어 완전히 용해시킨 후 표선까지 맞춘다.

4.4.3. 4.4.2용액을 아세톤으로 5배 희석한 것을 시험용액으로 한다.

4.4.4. 원심분리관에 시험용액 3 mL, Cholesterol esterase 용액 3 mL을 넣는다.

4.4.5. 37℃ 수욕에서 45분 동안 계속 교반하면서 반응시킨다.

4.4.6. 효소 분해 후 무수황산나트륨 1 g과 석유에테르 4 mL을 첨가하여 30초간 혼합한다.

4.4.7. 3,000 rpm에서 3분간 원심분리하여 석유에테르층을 시험관에   옮긴다.

4.4.8. 물층에 석유에테르 4 mL을 가하여 1회 반복 추출하여 석유    에테르층을 합한다.

4.4.9. 탈수된 석유에테르층을 질소가스를 이용하여 완전히 건조시킨 후, 이동상 3 mL을 넣고 용해시킨다.

4.4.10. 위 용액을 0.45 um 멤브레인 필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다.

5. 분석 및 계산

5.1 기기분석

항목	조건
주입량	20 μL
칼럼온도	25 ℃
이동상	헥산 : 아세톤 (82 : 18)
검출기 파장	474 nm
유속	1.2 mL/분

표 1. 아미노산분석계 조건(예)

5.2 계산

5.2.1 아스타잔틴 농도 (μg/mL) = (474 nm 흡광도 x 10,000) / 2,100

2,100 : 474 nm에서 1cm cuvette 의 1 % 아스타잔틴의 기준   흡광도값

5.2.2. 아스타잔틴 이성질체 용출 순서

trans 아스타잔틴, 9-cis 아스타잔틴, 13-cis 아스타잔틴 순으로  용출된다.

5.2.3. 총 피크면적 = Ptrans + (1.2 x P9-cis) + (1.6 x P13-cis)

Ptrans  : trans 아스타잔틴의 피크면적

P9-cis  : 9-cis 아스타잔틴의 피크면적

P13-cis  : 13-cis 아스타잔틴의 피크면적

1.2 : 9-cis를 trans 아스타잔틴으로 전환계수

1.6 : 13-cis를 trans 아스타잔틴으로 전환계수

5.2.4. 아스타잔틴 함량 (%) = (C x a x b x 100) / (S x 1,000)

C : 시험용액중의 아스타잔틴 농도(μg/mL)

a : 시험용액의 전량(mL)

b : 희석배수

S : 시료 채취량(mg)

제 4. 3. 3-53 코엔자임Q10을 다음과 같이 한다.

3-53 코엔자임Q10

1. 시험방법의 요약

본 시험법은 시료 중 코엔자임Q10을 헥산·무수에탄올혼합액으로 추출하여 액체크로마로그래프/자외부흡광광도검출기를 이용하여 분석하는 방법으로 최대흡수파장인 280 nm에서 정량분석 한다.

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 용매용 일회용 실린지

2.1.2 여과용 멤브레인필터 및 디스크형 멤브레인필터

2.1.3 액체크로마토그래프용 유리병

2.1.4 부피플라스크

2.1.5 초음파진탕기

2.2 분석장비

2.2.1 고속액체크로마토그래프

2.2.2 자외부흡광광도검출기

2.2.3 옥타데실실릴화한 칼럼(안지름 4.6 mm, 길이 150 mm, 충전제 Octadecyl silica) 또는 이와 동등한 것

2.3 분석장비의 준비

이동상을 이용하여 용매를 분당 1.0 mL로 충분한 시간동안 흘려 안정화 시킨다.

3. 표준물질 및 일반시약

3.1 표준물질

3.1.1 코엔자임Q10(Coenzyme Q10, Ubiquinone, Ubidecarenone)

분자식 : C59H90O4, 분자량 : 863.37, CAS No. : 303-98-0

3.2 일반시약

3.2.1 헥산(n-Hexane)

3.2.2 에탄올(Ethanol)

3.2.3 무수염화제이철(Ferric chloride, anhydrous)

3.2.4 아세토니트릴(Acetonitrile)

3.2.5 테트라하이드로퓨란(Tetrahydrofuran)

3.3 시액의 조제

3.3.1 1% 무수염화제이철용액

무수염화제이철 1 g에 에탄올을 가하여 100 mL로 한다.

4. 시험과정

4.1 표준용액 제조

4.1.1 표준물질인 코엔자임Q10 10 mg을 정밀히 칭량하여 10 mL   부피플라스크에 넣어 헥산·무수에탄올혼합액(5 : 2)으로 용해한 후 표선까지 정용한다.

4.1.2 위의 표준원액을 헥산·무수에탄올혼합액(5 : 2)으로 적정농도로 단계별 희석한다.

4.1.3 4.1.2의 희석한 표준원액 10 mL를 취하여 1% 무수염화제이철 용액 2.5 mL를 넣은 다음 무수에탄올로 정확하게 25 mL로 하여  표준용액으로 한다.

4.2 시험용액 제조

4.2.1 시료 약 10 mg(코엔자임Q10으로서)을 정밀히 칭량하여 100 mL 부피플라스크에 넣는다.

4.2.2 헥산·무수에탄올혼합액(5 : 2)을 넣어 시료가 전부 용해될 때 까지 초음파 진탕기로 용해시킨 후 표선까지 정용한다.

4.2.3 이 액 10 mL를 취하여 25 mL 부피플라스크에 넣는다.

4.2.4 여기에 1% 무수염화제이철용액 2.5 mL를 넣은 다음 무수에탄올을 넣어 25 mL가 되게 정용한다.

4.2.5 0.45 μm 멤브레인 필터로 여과한 용액을 시험용액으로 한다.

5. 분석 및 계산

5.1 기기 분석

표.1 고속액체크로마토그래프 조건(예)

항목	조건
주입량	10 μL
칼럼온도	40 ℃
이동상	아세토니트릴:테트라하이드로퓨란:물(55 : 40 : 5)
검출기 파장	280 nm
유속	1.0 mL/min

5.2 계산

5.2.1 코엔자임Q10(mg/g) = C × a/S × P × 1/1,000

C : 시험용액 중의 코엔자임Q10 농도(μg/mL)

a : 시험용액의 전량(mL)

S : 시료 채취량(g)

P : 표준품의 순도

1/1,000 : 단위 환산 계수

제 4. 3. 3-55 4. 4.2 4.2.4을 다음과 같이 신설한다.

4.2.4 젤리시료제품

4.2.4.1 시료 약 3～4 g을 분액여두에 취하고 n-Hexane 100 mL 및 70% 메탄올 100 mL를 가하여 3시간동안 진탕 추출한다.

4.2.4.2 층이 완전히 분리될 때까지 정치한 다음 하층을 환저플라스크에 취하여 수욕 중에서 감압농축하고 농축물을 증류수 10 mL에 용해한 후 여과(0.45 μm)하여 시험용액으로 한다.

제 4. 3. 3-58 “유산간균 및 구균”을 “유산균수”로 하고, 다음과 같이 한다.

3-58 유산균수

1. 시험방법의 요약

본 시험법은 시료에 함유된 유산균을 MRS 배지 또는 BL 배지를 사용하여 배양하는 방법으로 배양 후 유산균의 집락을 계수한다

2. 기기와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 고압멸균기(Autoclave)

2.1.2 고압멸균가능 병

2.1.3 무균대(Clean bench)

2.1.4 도말봉(Spreader, 스프레더)

2.1.5 마개 있는 시험관

2.1.6. 소독용 알콜 램프

2.1.7. 항온배양기(Incubator)

3. 일반시약 및 일반시액

3.1 일반시약

3.1.1 에탄올(Ethanol)

3.2 시액 및 배지의 조제

3.2.1 멸균생리식염수(Saline)

3.2.1.1	Sodium Chloride 8.5 g에 증류수를 가하여 1,000 mL로 하고 121℃로 멸균한다.

3.2.2 펩톤식염완충액(Buffered Peptone Water)

3.2.2.1 Peptone 10 g, Sodium Chloride 5 g, Disodium Phosphate 3.5 g, Mono-potassium Phosphate 1.5 g을 증류수 1,000 mL에 가하여 pH를 7.2±0.2로 조정한 후 121℃에서 15분간 고압 멸균한다.

3.2.3 MRS 배지

3.2.3.1 Enzyme Digest of Casein 10 g, Meat Extract 10 g, Yeast Extract 4 g, Glucose 20 g, Polysorbate 80(Tween 80) 1.08 g, Triammonium Citrate 2 g, Sodium Acetate 5 g, Magnesium Sulfate 7H2O 0.2 g, Manganese Sulfate 4H2O 0.05 g, Dipotassium hydrogen Phosphate 2 g, Agar 15 g을 증류수 1,000 mL에 녹이고 pH를 5.7±0.1로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균한다.

3.2.4 BL 한천배지(BL Agar)

3.2.4.1 Beef Extract 3 g, Liver Extract 5 g, Yeast Extract 5 g, Proteose Peptone 10 g, Tryptone  5 g, Soypeptone 3 g, Soluble Starch 0.5 g, Glucose 10 g, Dipotassium Phosphate  1 g, Monopotassium Phosphate 1g, Magnesium Sulfate 0.2g, Sodium Chloride 0.01g, Manganese Sulfate 0.00674 g, L-Cysteine‧HCl‧H2O 0.5 g, Ferrous Sulfate  0.01 g, Polysorbate 80(Tween 80)  1 g, Agar  15 g을 증류수 1,000 mL에 녹이고 pH를 7.2로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균하여, 50℃로 냉각 후 소, 말, 양 또는 사람의 탈섬유소 혈액을 5%가 되도록 첨가한다(BL 한천배지 사용도 무관함).

4. 시험과정

4.1 시험용액의 조제

4.1.1 액상시료

4.1.1.1 채취된 시료를 강하게 진탕하여 혼합한 것을 시험용액으로 한다.

4.1.2 반유동상시료

4.1.2.1 채취된 시료를 멸균유리봉과 멸균스파테르 등으로 잘 혼합한다.

4.1.2.2 그 일정량(10～25 mL)을 멸균용기에 취해 9배 양의 희석액과  혼합한 것을 시험용액으로 한다.

4.1.3 고체시료

4.1.3.1 채취된 시료의 일정량(10～25 g)을 멸균된 가위와 칼 등으로   잘게 자른다.

4.1.3.2 희석액을 가해 균질기를 이용해서 가능한 한 저온으로 균질화한다.

4.1.3.3 여기에 희석액을 가해서 일정량(100～250 mL)으로 한 것을  시험용액으로 한다.

4.1.4 분말상시료

4.1.4.1 시료를 멸균유리봉과 멸균스파테르 등으로 잘 혼합한다.

4.1.4.2 그 일정량(10 g)을 멸균용기에 취해 9배 양의 희석액과 혼합한 것을 시험용액으로 한다.

4.1.5 캡슐제품류

4.1.5.1 캡슐을 포함하여 시료의 일정량(10～25 g)을 취한다.

4.1.5.2 9배 양의 희석액을 가해 균질기와 스토마커 등을 이용하여   균질화한 것을 시험용액으로 한다.

4.1.6 냉동제품

4.1.6.1 냉동상태의 시료를 포장된 상태 그대로 40℃이하에서 될 수  있는 대로 단시간에 녹여 용기, 포장의 표면을 70% 알코올 솜으로 잘 닦은 후 상기 4.1.1～4.1.5의 방법으로 시험용액을 조제한다.

4.1.7 시험용액조제 시 주의사항

4.1.7.1 시험용액 제조 희석액은 멸균생리식염수 또는 펩톤식염완충액을 사용한다.

4.1.7.2 위와 같이 조제된 시험원액에 대해서는 희석액 9 mL에 시험원액  1 mL를 취하여 10배 희석액으로 만든다.

4.1.7.3 필요에 따라 100배, 1,000배 등 단계별 희석용액을 만들어 사용 할 수 있다.

4.1.7.4 시험용액의 조제 시 시료를 용기 포장한 대로 채취할 때에는 그 외부를 물로 씻고 자연 건조시킨 다음 마개 및 그 하부 5～10 cm의 부근까지 70% 알코올 탈지면으로 닦고, 화염멸균한 후 냉각하고 멸균한 기구로 개봉 또는 개관하여 2차 오염을 방지하여야 한다. 지방분이 많은 시료의 경우는 Polysorbate 80(Tween 80)과 같은 세균에 독성이 없는 계면활성제를 첨가할 수 있다.

4.1.7.5 실험을 실시하기 직전에 잘 균질화 하고 검사시료에 따라 시험 용액을 조제한다.

4.2 시험의 조작

4.2.1 유산균수 측정방법은 MRS 배지 또는 BL 한천배지를 사용하여 유산균의 집락을 계수한다.

4.2.2 시료 10∼25 g(mL)에 9배 희석액을 가하여 100∼250 mL이 되게 하고 균질화한다(10-1용액).

4.2.3 시험용액(10-1용액) 1 mL에 희석액을 가하여 10 mL이 되게 하여 10-2시험용액을 만든 후 동일하게 조작하여 희석한다.

4.2.4 BL 한천배지 시험 조작

4.2.4.1 각 희석 시험용액 0.1 mL씩을 BL 한천배지 2매 이상에 접종하며 멸균초자봉으로 도말한다. 시료가 접종된 페트리접시(Pretridish)는 35∼37℃에서 48∼72±3시간 혐기배양한다. 배양 후 생성된   집락수를 측정하고 희석배수를 곱하여 검사 시료 g당 균수를 산출한다(접종량도 희석배수에 고려해야 한다).

4.2.5 MRS 배지 시험 조작

4.2.5.1 각 단계별 희석액 1 mL씩을 멸균 페트리접시(Pretridish) 2매 이상씩에 무균적으로 취한다.

4.2.5.2 약 43～45℃로 유지한 MRS 배지 약 15 mL을 무균적으로 분주한다.

4.2.5.3 페트리접시(Pretridish) 뚜껑에 부착하지 않도록 주의하면서 조용히 회전하여 좌우로 기울이면서 시료와 배지를 잘 섞고 냉각 응고시킨다. 단, 시료를 취하여 배지를 가할 때까지의 시간은  20분 이상 경과하여서는 안 된다.

4.2.5.4 냉각 응고시킨 페트리접시(Pretridish)는 거꾸로 하여 35∼37℃에서 48∼72±3시간 혐기배양한다.

4.2.5.5 배양 후 생성된 집락수를 측정한다.

4.2.6 집락수 산정

4.2.6.1 배양 후 즉시 생성된 집락수를 계산한다. 단, 부득이할 경우에는 5℃에 보존시켜 24시간 이내에 산정한다.

4.2.6.2 집락수의 계산은 확산집락이 없고(전면의 1/2이하 일 때에는  지장이 없음) 1평판 당 30∼300개의 집락을 생성한 평판을 택하여 집락수를 계산하는 것을 원칙으로 한다. 전 평판에 300개 이상 집락이 발생한 경우 300에 가까운 평판에 대하여 밀집평판   측정법에 따라 안지름 9 cm의 페트리접시(Pretridish)인 경우에는 1 cm2내의 평균집락수에 65를 곱하여 그 평판의 집락수로 계산한다. 전 평판에 30개 이하의 집락만을 얻었을 경우에는 가장 희석배수가 얕은 것을 측정한다.

4.2.7 유산균수의 기재보고

4.2.7.1 시료 1 mL 중의 유산균수를 기재 또는 보고할 경우에 그것이 어떤 제한된 것에서 발육한 집락을 측정한 수치인 것을 명확히 하기 위하여 1평판에 있어서의 집락수는 상당 희석배수로 곱하고 1 mL 중(1 g 중)의 유산균수 몇 개라고 기재보고하며 동시에  배양온도를 기록한다. 숫자는 앞에서부터 두 번째 자리 숫자까지 유효숫자로 하며 세 번째 자리숫자에서 반올림하여 그 이하를 0으로 한다.

제 4. 3. 3-59 “비피더스균(Bifidobacterium)”을 “유산간·구균 및 비피더스균”으로 하고 다음과 같이 한다.

3-59 유산간·구균 및 비피더스균

1. 시험방법의 요약

본 시험법은 유산간·구균과 비피더스균을 구분하여 산정해야 하는 경우에 한하며, 유산간·구균은 BCP첨가 평판측정용배지를 사용하고 비피더스균은 TOS-MUP 배지를 사용한 시험방법에 따라 시험한 후 산출한다.

2. 기구와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 고압멸균기(Autoclave)

2.1.2 고압멸균가능병

2.1.3 무균대(Clean bench)

2.1.4 도말봉(Spreader, 스프레더)

2.1.5 마개 있는 시험관

2.1.6. 소독용 알콜 램프

2.1.7. 항온배양기(Incubator)

3. 일반시약 및 일반시액

3.1 일반시약

3.1.1 에탄올(Ethanol)

3.2 시액 및 배지의 조제

3.2.1 멸균생리식염수(Saline)

3.2.1.1	Sodium Chloride 8.5 g에 증류수를 가하여 1,000 mL로 하고 121℃로 멸균한다.

3.2.2 펩톤식염완충액(Buffered Peptone Water)

3.2.2.1 Peptone 10 g, Sodium Chloride 5 g, Disodium Phosphate 3.5 g, Mono-potassium Phosphate 1.5 g을 증류수 1,000 mL에 가하여 pH를  7.2±0.2로 조정한 후 121℃에서 15분간 고압 멸균한다.

3.2.3 BCP첨가 평판측정용 한천배지(Plate Count Agar with Brom Cresol Purple)

3.2.3.1 Yeast Extract 2.5 g, Peptone 5.0 g, Dextrose 1.0 g, Polysorbate 80(Tween 80) 1.0 g, L-Cysteine 0.1 g, Agar 15.0 g(다만, 종균에 따라 적정 peptone을 사용하여야 함)을 증류수 1,000 mL에 녹여 pH 6.8～7.0으로 조정한 후 BCP(Brom cresol purple)을 0.004∼0.006%가 되도록 가한다.

3.2.3.2 121℃에서 15분간 멸균한다.

3.2.4 TOS-MUP 배지

3.2.4.1 Trypticase peptone 10 g, Yeast Extract 1 g, KH2PO4 3 g, K2HPO4 4.8 g, (NH4)2SO4 3 g, Magnesium Sulfate 7H2O 0.2 g, (R)-Cysteine-HCL·H2O 0.5 g, Sodium propionate 15 g, TOS(Galactooligosaccharide) 10 g, Agar 15 g를 증류수 950 mL에 녹이고 pH를 6.3±0.2로 조정한 후 115℃에서 15분간 멸균하여 50℃정도로 식힌 다음 MUP(mupirocin) supplement(1 mg/mL)를 주사필터(0.22 ㎛)한 후 50 mL을 위의 배지에 첨가한다.

4. 시험과정

4.1 시험용액의 조제

4.1.1 액상시료

4.1.1.1 채취된 시료를 강하게 진탕하여 혼합한 것을 시험용액으로 한다.

4.1.2 반유동상시료

4.1.2.1 채취된 시료를 멸균유리봉과 멸균스파테르 등으로 잘 혼합한다.

4.1.2.2 그 일정량(10∼25 mL)을 멸균용기에 취해 9배 양의 희석액과 혼합한 것을 시험용액으로 한다.

4.1.3 고체시료

4.1.3.1 채취된 시료의 일정량(10～25 g)을 멸균된 가위와 칼 등으로 잘게 자른다.

4.1.3.2 희석액을 가해 균질기를 이용해서 가능한 한 저온으로 균질화한다.

4.1.3.3 여기에 희석액을 가해서 일정량(100∼250 mL)으로 한 것을 시험용액으로 한다.

4.1.4 분말상시료

4.1.4.1 시료를 멸균유리봉과 멸균스파테르 등으로 잘 혼합한다.

4.1.4.2 그 일정량(10 g)을 멸균용기에 취해 9배 양의 희석액과 혼합한 것을 시험용액으로 한다.

4.1.5 캡슐제품류

4.1.5.1 캡슐을 포함하여 시료의 일정량(10～25 g)을 취한다.

4.1.5.2 9배 양의 멸균생리식염수를 가해 균질기와 스토마커 등을 이용하여 균질화한 것을 시험용액으로 한다.

4.1.6 냉동제품

4.1.6.1 냉동상태의 시료를 포장된 상태 그대로 40℃이하에서 될 수 있는 대로 단시간에 녹여 용기, 포장의 표면을 70% 알코올 솜으로 잘 닦은 후 상기 4.1.1∼4.1.5의 방법으로 시험용액을 조제한다.

4.1.7 시험용액조제 시 주의사항

4.1.7.1 시험용액 제조 희석액은 멸균생리식염수 또는 펩톤식염완충액을 사용한다.

4.1.7.2 위와 같이 조제된 시험원액에 대해서는 희석액 9 mL에 시험 원액 1 mL를 취하여 10배 희석액으로 만든다.

4.1.7.3 필요에 따라 100배, 1,000배 등 단계별 희석용액을 만들어 사용할 수 있다.

4.1.7.4 시험용액의 조제 시 시료를 용기 포장한 대로 채취할 때에는 그 외부를 물로 씻고 자연 건조시킨 다음 마개 및 그 하부 5∼10 cm의 부근까지 70% 알코올 탈지면으로 닦고, 화염멸균한 후 냉각하고 멸균한 기구로 개봉 또는 개관하여 2차 오염을  방지하여야 한다. 지방분이 많은 시료의 경우는 Polysorbate 80(Tween 80)과 같은  세균에 독성이 없는 계면활성제를 첨가할 수 있다.

4.1.7.5 실험을 실시하기 직전에 잘 균질화 하고 검사시료에 따라 시험용액을 조제한다.

4.2 시험의 조작

4.2.1 BCP첨가 평판측정용 배지를 사용한 경우

4.2.1.1 3-58 유산균수 MRS 배지에 준하여 시험하고 35～37℃에서   48～72±3시간 호기 또는 혐기 배양한 후 발생한 황색의 집락을 유산균으로 계수한다.

4.2.2 TOS-MUP 배지를 사용한 경우

4.2.2.1 3-58 유산균수 MRS 배지에 시험하고, 35∼37℃에서 48∼72±3시간 혐기 배양한다.

4.2.2.2 모든 시험에서는 시험용액을 가하지 아니한 동일 희석액    0.1 mL을 대조시험액으로 하여 시험조작의 무균여부를 확인한다.

4.2.3 집락수의 산정

4.2.3.1 3-58 유산균수의 4.2.6 집락수 산정에 따라 산정한다.

4.2.4 유산균의 기재보고

4.2.4.1 3-58 유산균수의 4.2.7 유산균의 기재보고에 따라 산정한다.

제 4. 3. 3-66 2. 2.3을 다음과 같이 신설한다.

2.3 분석장비의 준비

이동상으로서 0.1% 인산을 함유한 아세토니트릴과 0.1% 인산용액을 40 : 60으로 혼합하여 분당 1.0 mL씩 흘려줌으로서 칼럼과 기기를   안정화 시킨다.

제 4. 3. 3-66 5. 5.1 표1 이동상 조건인 “A : 메탄올, B : 0.85% 인산을 함유한 증류수”를 “ 0.1% 인산을 함유한 아세토니트릴 : 0.1% 인산용액 = 40 : 60”으로 하고, 표2를 삭제한다.

부 칙

제1조(시행일) 이 고시는 고시한 날부터 즉시 시행한다.

제2조(적용례) 이 고시는 이 고시 시행 이후 최초로 제조·가공 또는 수입한 건강기능식품(원료를 포함한다)부터 적용한다.

제3조(경과조치) ① 이 고시 시행 당시 검사가 접수되어 진행 중인 사항에 대하여는 종전의 규정에 따른다.

② 이 고시 시행 당시 종전의 규정에 따라 제조․가공․수입(선적일을 기준으로 한다)한 건강기능식품은 종전의 규정에 따른다. 이 경우 해당 건강기능식품은 유통기한까지 판매할 수 있다.

현  행

개 정 안

제 1. 총칙

(생  략)

제 2. 공통기준 및 규격

1. ∼ 4. (생  략)

5. 보존 및 유통기준

1) ∼ 8) (생  략)

9) 포장된 건강기능식품은 소분 판매하지 말아야 하며(다만, 우수건강기능식품제조기준 적용업소가 소비자가 직접 구매 가능하도록 포장된 건강기능식품 이외의 제품을 소분하도록 적합한 시설을 갖추고 품목제조신고한 경우는 제외한다),「건강기능식품의 표시기준」(식품의약품안전처 고시) 적합하지 않거나 표시가 없는 것을 보존하거나 판매하지 말아야 한다.

10) 보관과정 중의 부주의로 인하여 부패·변질 또는 파손된 제품을 판매하여서는 아니 된다.

11) 냉동건강기능식품을 해동시켜 실온 또는 냉장건강기능식품으로 유통시켜서는 아니 되며, 실온 또는 냉장건강식품을 냉동시켜 냉동건강기능식품으로 유통시켜서는 아니 된다. 또한 냉장건강기능식품을 실온에서 유통시켜서는 아니 된다.

12) 「건강기능식품의 기준 및 규격」에서 정하지 않은 보존 및 유통기준은「식품의 기준 및 규격」을 따른다.

제 1. 총칙

(현행과 같음)

제 2. 공통기준 및 규격

1. ∼ 4. (현행과 같음)

5. 보존 및 유통기준

1) ∼ 8) (현행과 같음)

<삭  제>

9) ----------------------------------------------------------------------------.

10) --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------.

11) --------------------------------------------------------------------------------.

제 3. 개별 기준 및 규격

(생  략)

제 4. 건강기능식품 시험법

1. (생  략)

2. 일반시험법

2-1 ∼ 2-4  (생  략)

2-5 유해물질시험법

2-5-5 초산에틸

1. ∼ 3. (생  략)

4. 시험과정

4.1 표준용액의 조제

4.1.1 초산에틸 1.00 mL을 취하여 100 mL 부피플라스크에 넣는다.

4.1.2 (생  략)

4.1.3 4.1.2의 표준원액을 톨루엔으로 적절히 희석하여 1250, 2500, 5000 ppm 표준용액으로 사용한다.

4.1.4 (생  략)

4.2 검량선 작성용액의 조제

4.2.1 ∼ 4.2.2 (생  략)

4.2.3	표준원액 1250, 2500, 5000 ppm인 표준용액 100μL를 각각 넣은 후 다음의 시험조작에서 검량선 작성용액으로 사용한다. 이 용액은 각각 1, 2, 5 ppm의 농도가 된다.

4.3 (생  략)

5. (생  략)

제 3. 개별 기준 및 규격

(현행과 같음)

제 4. 건강기능식품 시험법

1. (현행과 같음)

2. 일반시험법

2-1 ∼ 2-4  (현행과 같음)

2-5 유해물질시험법

2-5-5 초산에틸

1. ∼ 3. (현행과 같음)

4. 시험과정

4.1 표준용액의 조제

4.1.1 ---------1 g을-------       --------------------

---.

4.1.2 (현행과 같음)

4.1.3 --------------------        -------------------        ------5000 μg/mL ----

---------------.

4.1.4 (현행과 같음)

4.2 검량선 작성용액의 조제

4.2.1 ∼ 4.2.2 (현행과 같음)

4.2.3 -------------------          ---μg/mL인--------

-------------------

-------------------

-------------------

--------------5, 10,          20 μg/mL의-------.

4.3 (현행과 같음)

5. (현행과 같음)

3. 개별성분별 시험법

3-1 비타민 A

3-1-1 비타민 A(제1법)

1. (생  략)

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 (생  략)

2.1.2 분액깔때기

2.2 ∼ 2.3 (생  략)

3. (생  략)

4. 시험과정

4.1 (생  략)

4.2 표준용액 제조

4.2.1 ∼ 4.2.7 (생  략)

4.2.8 위의 용액 250～300 mL 분액깔때기에 옮긴다. 이 때 침전물이 발생한 경우 침전물을 씻어 옮길 필요는 없다.

4.2.9 분액깔때기에 1 N 수산화칼륨액 100 mL을 가하여 15초간 흔들어준 후 방치한다.

4.2.10 ∼ 4.2.11 (생  략)

4.2.12 분액깔때기를 정치하여 벤젠층과 물층을 완전히 분리한다.

4.2.13 ∼ 4.2.17 (생  략)

4.3 ∼ 4.4 (생  략)

5. (생  략)

3. 개별성분별 시험법

3-1 비타민 A

3-1-1 비타민 A(제1법)

1. (현행과 같음)

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 (현행과 같음)

2.1.2 갈색분액깔때기

2.2∼2.3 (현행과 같음)

3. (현행과 같음)

4. 시험과정

4.1 (현행과 같음)

4.2 표준용액 제조

4.2.1 ∼ 4.2.7 (현행과 같음)

4.2.8	----------------갈색분액깔때기에--------- ------------------- ------------------- ----.

4.2.9 갈색분액깔때기에------

--------------------

--------------------

-----.

4.2.10 ∼ 4.2.11 (현행과 같음)

4.2.12 갈색분액깔때기를-----

-------------------

--------.

4.2.13 ∼ 4.2.17 (현행과 같음)

4.3 ∼ 4.4 (현행과 같음)

5. (현행과 같음)

3-1-2 비타민 A(제2법)

1. (생  략)

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 ∼ 2.1.4 (생  략)

2.1.5 분액깔때기

2.1.6 (생  략)

2.2 ∼ 2.3 (생  략)

3. (생  략)

4. 시험과정

4.1 ∼ 4.2 (생  략)

4.3 시험용액 제조

4.3.1 ∼ 4.3.2 (생  략)

4.3.3	신속히 냉각하여 물 30 mL을 가하여 200 mL 분액깔때기에 옮긴다.

4.3.4 증류플라스크를 물 10 mL로 씻어 분액깔때기에 합친다.

4.3.5 증류플라스크를 석유에테르 30 mL로 씻은 후 분액깔때기에 합한다.

4.3.6 ∼ 4.3.7 (생  략)

4.3.8	분액깔때기에서 물층을 충분히 분리한 석유에테르층을 취하여 무수황산나트륨으로 탈수하여 증류플라스크에 옮긴다.

4.2.9 ∼ 4.3.11 (생  략)

5. (생  략)

3-1-2 비타민 A(제2법)

1. (현행과 같음)

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 ∼ 2.1.4 (현행과 같음)

2.1.5 갈색분액깔때기

2.1.6 (현행과 같음)

2.2 ∼ 2.3 (현행과 같음)

3. (현행과 같음)

4. 시험과정

4.1 ∼ 4.2 (현행과 같음)

4.3 시험용액 제조

4.3.1∼4.3.2 (현행과 같음)

4.3.3 --------------------

---------------갈색분액깔때기에-----.

4.3.4 -------------------

---갈색분액깔때기에 -.

4.3.5 --------------------

------------갈색분액깔때기에 -----.

4.3.6 ∼ 4.3.7 (현행과 같음)

4.3.8 갈색분액깔때기에서----

-------------------

-------------------

-------------------

--------------.

4.2.9 ∼ 4.3.11 (현행과 같음)

5. (현행과 같음)

3-2 (생  략)

3-3 비타민 D

1. ∼  3. (생  략)

4. 시험과정

4.1 ∼ 4.2 (생  략)

4.3 시험용액의 제조

4.3.1 ∼ 4.3.5 (생  략)

4.3.6 헥산층을 250 mL 분액깔대기에 옮겨 1 N 수산화칼륨 100 mL을 가하여 15초간 강하게 진탕 혼합한다.

4.3.7 ∼ 4.3.11 (생  략)

5. (생  략)

3-2 (현행과 같음)

3-3 비타민 D

1. ∼  3. (현행과 같음)

4. 시험과정

4.1 ∼ 4.2 (현행과 같음)

4.3 시험용액의 제조

4.3.1 ∼ 4.3.5 (현행과 같음)

4.3.6 -------------분액깔때 기에 ----------------

--------------------

--------------------

-----.

4.3.7 ∼ 4.3.11 (현행과 같음)

5. (현행과 같음)

3-4 비타민 E

3-4-1 (생  략)

3-4-2 비타민 E(제2법)

1. ∼ 3. (생  략)

4. 시험과정

4.1 ∼ 4.2 (생  략)

4.3 시험용액 제조(일반식품)

4.3.1 ∼ 4.3.7 (생  략)

4.3.8 분액깔대기에서 물층을 충분히 분리한 석유에테르층을 취하여 무수황산나트륨으로 탈수하여 증류플라스크에 옮긴다.

4.3.9 ∼ 4.3.11 (생  략)

4.4 (생  략)

5. (생  략)

3-4 비타민 E

3-4-1 (현행과 같음)

3-4-2 비타민 E(제2법)

1. ∼ 3. (현행과 같음)

4. 시험과정

4.1 ∼ 4.2 (현행과 같음)

4.3 시험용액 제조(일반식품)

4.3.1 ∼ 4.3.7 (현행과 같음)

4.3.8 분액깔때기에서-------

-------------------

-------------------

-------------------

------------------.

4.3.9 ∼ 4.3.11(현행과 같음)

4.4 (현행과 같음)

5. (현행과 같음)

3-5 비타민 K

3-5-1 (생  략)

3-5-2 비타민 K(제2법)

1. (생  략)

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 ∼ 2.1.4 (생  략)

2.1.5 분액깔대기(500 mL)

2.1.7 감압농축기

2.1.8 정제컬럼(1.0 cm ID × 30 cm, 유리컬럼)

2.1.9 시험관(200 × 24 mm ID)

2.2 (생  략)

3. ∼ 5. (생  략)

3-6 ∼ 3-7 (생  략)

3-5 비타민 K

3-5-1 (현행과 같음)

3-5-2 비타민 K(제2법)

1. (현행과 같음)

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 ∼ 2.1.4 (현행과 같음)

2.1.5 분액깔때기(500 mL)

2.1.6 ----------

2.1.7 -------------------

------------

2.1.8 -------------------

2.2 (현행과 같음)

3. ∼ 5. (현행과 같음)

3-6 ∼ 3-7 (현행과 같음)

3-8 나이아신

3-8-1 ∼ 3-8-2  (생  략)

3-8-3 나이아신(제3법)

1. 시험방법의 요약

본 시험법은 시료 중 니코틴산(나이아신)을 이동상으로 추출, 정제한 후 액체크로마토그래프/자외부흡광광도검출기를 이용하여 분석하는 방법으로 최대 흡수 파장인 260nm에서 정량 분석한다.

2. (생  략)

3. 표준물질 및 일반시약

3.1 표준물질

3.1.1 (생  략)

<신  설>

3.2 (생  략)

4. (생  략)

5. 분석 및 계산

5.1 (생  략)

5.2 계산

5.2.1 니코틴산(mg/100g) = C × (a × b)/S × 100/1,000

C : 시험용액 중의 니코틴산의 농도(μg/mL)

a : (생  략)

b : (생  략)

S : (생  략)

3-8 나이아신

3-8-1 ∼ 3-8-2 (현행과 같음)

3-8-3 나이아신(제3법)

1. 시험방법의 요약

------------나이아신(니코틴산과 니코틴산아미드)을 --

------------------------

------------------------

------------------------

------------------------.

2. (현행과 같음)

3. 표준물질 및 일반시약

3.1 표준물질

3.1.1  (현행과 같음)

3.1.2  Nicotinamide(Pyridine-3- carboxamide)분자식 : C6H6N2O, 분자량 : 122.13, CAS No. : 98-92-0

3.2 (현행과 같음)

4. (현행과 같음)

5. 분석 및 계산

5.1 (현행과 같음)

5.2 계산

5.2.1 나이아신(mg/100g) = C × (a × b)/S × 100/1,000

C : 시험용액 중의 니코틴산 및 니코틴산아미드 농도의 합(μg/mL)

a : (현행과 같음)

b : (현행과 같음)

S : (현행과 같음)

3-9 ∼ 3-10 (생  략)

3-11 엽산

3-11-1 (생  략)

3-11-2 엽산(제2법)

1. (생  략)

2. 장비와 재료

2.1 ∼ 2.2 (생  략)

2.3 분석장비의 준비

이동상은 A용액(5 mM sodium hexanesulfonate /0.1% 초산 용액), B용액(5 mM sodium hexanesulfonate/0.1% 초산 용액 : 메탄올(70:30))을 이용하여 분당 1.0 mL로 충분한 시간동안 흘려 안정화 시킨다.

3. ∼ 5. (생  략)

3-9 ∼ 3-10 (현행과 같음)

3-11 엽산

3-11-1 (현행과 같음)

3-11-2 엽산(제2법)

1. (현행과 같음)

2. 장비와 재료

2.1 ∼ 2.2 (현행과 같음)

2.3 분석장비의 준비

-----A용액(5 mM  Tetrabutyl ammonium bromide 용액),  아세토니트릴을 --------------

-------------------------

------------------------ ---------------------------------------.

3. ∼ 5. (현행과 같음)

3-12 비타민 B12

3-12-1 (생  략)

3-12-2 비타민 B12(제2법)

1. 시험방법의 요약

본 시험법은 시료 중 존재하는 비타민B12을 옥타데실화한 칼럼으로 피리독신염산염을 분리하는 방법으로 비타민B12의 측정파장 550 nm에서 검출하여 정량한다.

2. 장비와 재료

2.1 (생  략)

2.2 분석장비

2.2.1 ∼ 2.2.2 (생  략)

2.2.3 Capcellpak MF C8 (안지름 4.6 mm, 길이 150 mm, 충진입자 크기 5 μm) 또는 이와 동등한 것

2.2.4 Capcellpak MG C18 (안지름 2.0 mm, 길이 35 mm, 충진입자 크기 5 μm) 또는 이와 동등한 것

2.2.5 Capcellpak UG C18 (안지름 1.5 mm, 길이 250 mm, 충진입자 크기 5 μm) 또는 이와 동등한 것

2.2.6. <신 설>

2.3 분석장비의 준비

이동상으로 사용되는 5mM KH2PO4 용액을 분당 500 μL씩 흘려줌으롯써 기기와 칼럼을 안정화 시킨다.

3. ∼ 4. (생  략)

5. 분석 및 계산

5.1 기기분석

표 1. 고속액체크로마토그래프 조건(예)

항목	조건
주입량	10 μL
칼럼온도	(생 략)
이동상	5 mM KH2PO4/Methanol (80/20)
검출기 파장	(생 략)
유량	120 μL/분

5.2 (생  략)

3-12 비타민 B12

3-12-1 (현행과 같음)

3-12-2 비타민 B12(제2법)

1. 시험방법의 요약

--------------- 비타민B12을 이동상으로 추출하고 액체크로마토그래프(육방전환밸브시스템)/자외부흡광광도검출기를 이용하여 분석하는 방법으로 최대흡수파장인 550 nm에서 정량분석 한다.

2. 장비와 재료

2.1 (현행과 같음)

2.2 분석장비

2.2.1 ∼ 2.2.2 (현행과 같음)

2.2.3 육방전환밸브시스템

2.2.4 전처리 컬럼 : Capcellpak MF C8 (안지름 4.6 mm, 길이 150 mm, 충진입자 크기 5 μm) 또는 이와 동등한 것

2.2.5 농축 컬럼 : Capcellpak MG C18 (안지름 2.0 mm, 길이 35 mm, 충진입자 크기 5 μm) 또는 이와 동등한 것

2.2.6 분석 컬럼 :Capcellpak UG C18(안지름 1.5 mm, 길이 250 mm, 충진입자 크기 5 μm) 또는 이와 동등한 것

2.3 분석장비의 준비

이동상은 5 mM 인산이수소  칼륨(KH2PO4) 용액과 5 mM 인산이수소칼륨(KH2PO4)용액:메탄올(80:20)을 이용하여 전처리칼럼은 분당 500 μL, 분석칼럼은 분당 120 μL를 충분한 시간동안 흘려 안정화 시킨다.

3. ∼ 4. (현행과 같음)

5. 분석 및 계산

5.1 기기분석

표 1. 고속액체크로마토그래프 조건(예)

항목	조건
주입량	200 μL
칼럼온도	(현행과 같음)
이동상	전처리컬럼 : 5mM 인산이수소칼륨(KH2PO4) 용액 분석컬럼 : 5 mM 인산이수소칼륨(KH2PO4) 용액 /메탄올(MeOH)(80:20)
검출기 파장	(현행과 같음)
유량	전처리컬럼: 500 μL/분 분석컬럼: 120 μL/분

5.2 (현행과 같음)

3-13 (생  략)

3-14 비타민 C

3-14-1 ∼ 3-14-2 (생  략)

3-14-3 비타민 C(제3법)

1. ∼ 4. (생  략)

5. 분석 및 계산

5.1 (생  략)

5.2. 정량시험

5.2.1 (생  략)

5.2.2 (생  략)

비타민 C(μg/100 g) =	S ×	a×b	×	100
		검체량(g)		1000

5.2.3 계산식

S : 시험용액 중의 아스코르빈산의 농도(ng/mL)

a : (생  략)

b : (생  략)

3-13 (현행과 같음)

3-14 비타민 C

3-14-1 ∼ 3-14-2 (현행과 같음)

3-14-3 비타민 C(제3법)

1. ∼ 4. (현행과 같음)

5. 분석 및 계산

5.1 (현행과 같음)

5.2. 정량시험

5.2.1 (현행과 같음)

5.2.2 (현행과 같음)

비타민 C(mg/100 g) =	S ×	a×b	×	100
		검체량(g)		1000

5.2.3 계산식

S : ----------------------

----- 농도(μg/mL)

a : (현행과 같음)

b : (현행과 같음)

<신  설>

3-14-4 비타민 C(제4법)

1. 시험방법의 요약

본 시험법은 시료 중 존재하는 아스코르빈산팔미테이트를 메탄올로 균질화시킨 후 옥타데실화된 칼럼을 연결하여 분리하는 방법으로 자외부흡광광도검출기를 이용하여 최대 흡수 파장인 245 nm에서 검출하여 정량한다.

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 용매용 일회용 실린지

2.1.2 여과용 멤브레인 필터 및 디스크형 멤브레인 필터

2.1.3 가지달린 삼각플라스크(Filter flask)

2.1.4 여지(Filter paper)

2.1.5 액체크로마토그래프용 유리병

2.1.6 부피플라스크

2.1.7 원심분리관

2.2 분석장비

2.2.1 고속액체크로마토그래프

2.2.2 자외부흡광광도검출기

2.2.3 옥타데실실릴화한 칼럼(안지름 4.6 mm, 길이 150 mm, 충전제 : octadecyl silica) 또는 이와 동등한 것

2.3 분석장비의 준비

이동상은 2개의 용매가 사용되는데 0.05 M KH2PO4 : 아세토니트릴(30 : 70) 이 두 개의 용매를 분당 1 mL씩 충분한 시간동안 흘려 기기와 칼럼을 안정화 시킨다.

3. 표준물질 및 일반시약

3.1 표준물질

3.1.1 Ascorbyl palmitate

분자식 : C22H38O7, 분자량 : 414.53, CAS No. : 137-66-6

3.2 일반시약

3.2.1 메탄올(Methanol)

3.2.2 아세토니트릴(Acetonitrile)

3.2.3 증류수(Distilled water)

3.2.4 인산칼륨(Potassium phosphate)

4. 시험과정

4.1 표준용액 제조

4.1.1 표준원액

아스코르빈산팔미테이트 10 mg을 정밀히 달아, 메탄올에 녹여 100 mL로 한 것을 표준원액으로 한다.

4.1.2 표준용액

필요한 경우 표준원액에 메탄올을 넣어 원하는 농도로 희석하여 사용한다. 사용 시 조제한다.

4.2 시험용액 제조

4.2.1 아스코르빈산팔미테이트 약  5 mg에 해당하는 시료를 10 mL 메탄올을 가하여 10분간 현탁시킨 후 적당량의 메탄올을 넣어 균질화한다.

4.2.2 균질화된 시료를 100 mL 메스플라스크에 옮기고 소량의 메탄올로 용기를 씻은 후 메스플라스크에 합하여 100 mL로 한다.

4.2.3 3,000 rpm에서 10～15분간 원심분리를 행하여 상등액을 취하고 메탄올로 적당히 희석하여 시험용액으로 한다.

5. 분석 및 계산

5.1 기기분석

표 1. 고속액체크로마토그래프 조건(예)

항목	조건
주입량	10 μL
칼럼온도	실온
이동상	0.05 M KH2PO4 : 아세토니트릴(30 : 70)
검출기 파장	245 nm
유량	1.0 mL/min

5.2 정량시험

5.2.1 시험용액 및 표준용액을 각각 10 μL씩 주입하여 얻은 피크의 넓이 또는 높이를 구하여 검량선을 작성한 후 시험용액의 아스코르빈산팔미테이트의 농도를 구한다.

5.2.2 계산식에 의해 시료 중 아스코르빈산의 함량을 산출한다.

5.2.3 계산식

비타민 C (mg/100 g)	=	S ×	a × b	×	100	×	0.4249
			검체량(g)		1,000

S : 시험용액 중의 아스코르빈산팔미테이트의 농도(μg/mL)

a : 시험용액의 전량(mL)

b : 시험용액의 희석배수

0.4249 : 아스코르빈산팔미테이트의 아스코르빈산으로의 환산계수

3-15 (생  략)

3-16 칼슘

3-16-1 ∼ 3-16-2 (생  략)

3-16-3 칼슘(제3법 원자흡광광도법)

1. ∼ 4. (생  략)

3-15 (현행과 같음)

3-16 칼슘

3-16-1 ∼ 3-16-2 (현행과 같음)

3-16-3 칼슘(제3법 유도결합플라즈마법)

1. ∼ 4. (현행과 같음)

3-17 ∼ 3-25 (생  략)

3-26 식이섬유

3-26-1 식이섬유(제1법)

1. (생  략)

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 비이커 : 400 또는 600 mL Tall-form

2.1.2 ∼ 2.1.12 (생  략)

3. (생  략)

4. 시험과정

4.1 시험용액의 조제

4.1.1 (생  략)

4.1.2 효소분해

4개의 400 mL(또는 600 mL)  tall-form 비이커에 시료 1.000± 0.005 g을 정밀히 달아 2개의 검체(M1, M2)를 준비하고 2개의 공시험(B1, B2)을 준비한다. 이에  MES-TRIS 완충용액 40 mL씩 가하여 시료가 뭉치지 않고 완벽하게 분산될 때까지 자석 교반하여 혼합한다. 저속으로 혼합하면서, 내열성 α-아밀라아제 용액 50 μL을 첨가한다. 비이커를 알루미늄박으로 덮은 후 95∼100℃ 수욕에서 15분 동안 계속 교반하면서 반응한다. 수욕의 온도가 95℃에 도달할 때부터 시작한다(보통 총 35분이면 충분하다). 수욕에서 모든 비이커를 꺼내어 60℃로 식힌다. 알루미늄박을 제거하고 비이커의 벽 또는 바닥에 생긴 겔 형태의 내용물을 시약스푼으로 긁어내어 용액 속에 분산시킨다. 비이커 벽과 시약스푼을 10 mL의 물로 씻어준다. 프로테아제 효소용액 100 μL을 각 비이커에 첨가한다. 알루미늄박으로 비이커를 덮고 60±1℃ 수욕에서 30분간 계속해서 교반하여 반응시킨다. 수욕의 온도가 60℃에 도달한 후 반응을 시작한다. 알루미늄박을 제거한 후 비이커를 잘 교반하면서 0.561 N HCl 5 mL을 넣어준다. 60℃에서 1 N NaOH, 1 N HCl를 사용하여 용액을 pH 4.0～4.7로 조정한다(※ 참고 : pH는 낮은 온도에서 올라가기 때문에 60℃에서 pH를 조정하고 확인하는 것이 중요하다. 대부분의 곡류, 채소 시료의 경우, pH 조정이 없이도 pH조건을 만족할 수 있으므로 이전에 확인된 시료의 경우, pH 조정 과정을 생략할 수 있다. 단, 공시험의 pH를 예비단계로 확인하고 만약 공시험의 pH가 올바른 범위를 벗어난다면, 반드시 시료의 pH를 점검한다). 비이커를 교반하면서 아미노글루코시다제 용액 300 μL를 첨가하고 알루미늄박으로 덮은 후 60±1℃ 수욕에서 교반하면서 30분간 항온한다. 수욕의 온도가 60℃에 도달할 때 반응을 시작한다.

4.2 총 식이섬유(TDF) 함량 측정

4.2.1 실온 기준 225 mL 95% 에탄올을 60℃에서 효소 분해된 각각의 시험용액에 가한다. 이때 에탄올과 시험용액의 부피 비율은 4 : 1이 되어야 한다. 수욕에서 비이커를 꺼내어 알루미늄박으로 덮고 실온에서 1시간 침전시킨다. ☆미리 규조토를 넣고 무게를 칭량한 유리여과기에  78% 에탄올 15 mL을 가하여 규조토를 분산시킨 후 흡인 여과하여 규조토층이 고르게 형성되도록 한다. 에탄올 처리된 효소 분해물을 준비된 유리여과기로 여과하고 78% 에탄올이 들어있는 세척병과 고무재질의 시약스푼를 이용하여 비이커의 잔류물을 유리여과기로 옮긴다. 이때 효소분해물에 엷은 막이 생성될 경우, 시약스푼으로 생성된 막을 깨고 여과한다. 진공을 유지하면서 78% 에탄올, 95% 에탄올, 아세톤 순으로 각각 15 mL씩 2회 잔류물을 씻는다. ★105℃에서 잔류물이 남아있는 유리여과기를 하룻밤 동안 건조시키고, 데시케이터에서 1시간 동안 방냉하여 항량한 후, 식이섬유 잔류물 및 규조토를 포함한 유리여과기의 무게를 0.1 mg 단위까지 칭량한다. 미리 칭량하여 확인한 규조토를 포함한 유리여과기의 무게를 빼서 식이섬유의 무게를 계산한다. 같은 두개의 시료 중 하나는 1.1.3.1 총질소 및 조단백질에 따라 단백질 함량을 측정한다. 이때 질소계수는 6.25를 사용한다. 다른 하나는 1.1.2. 회분에 따라 회분량을 확인한다. 이때 525℃에서 5시간 이상 회화하고 0.1 mg 단위까지 칭량한다. 미리 칭량하여 확인한 규조토를 포함한 유리여과기의 무게를 빼서 회분의 무게를 결정한다.

4.3 물불용성 식이섬유(IDF) 측정

4.3.1 미리 규조토를 넣어 항량하여 준비한 유리여과기에 물 3 mL을 가하여 규조토를 적시고 분산시킨 후 흡인여과하여 규조토층을 고르게 한다. 이에 시험용액 조제에서 얻어진 효소분해물을 유리여과기를 통해 여과용 플라스크로 여과한다. 비이커를 세척하면서 잔류물을 70℃ 물 10 mL로 2회 세척한다. 여액과 물 세척액을 합치고, 미리 무게를 칭량한 600 mL 비이커로 옮겨 9) 수용성 식이섬유 측정에 사용한다. 잔류물은 곧바로 78% 에탄올, 95% 에탄올 그리고 아세톤의 순으로 각각 15 mL씩 2회 세척한다(주의: 잔류물의 세척을 즉시 하지 않을 경우, IDF 값이 높아질 수 있다). 7) 총식이섬유 함량 측정 과정의 ★ 이하에 따라 IDF의 무게를 계산한다.

4.4 수용성 식이섬유(SDF) 측정

4.4.1 물불용성 식이섬유 측정에서 600 mL 비이커로 옮긴 여액과 물 세척액의 무게를 확인하여 부피를 확인하고 미리 60℃로 가열된 95% 에탄올을 측정한 부피의 4배량을 가한다. 이때 60℃ 에탄올의 일부를 이용하여 여과용 플라스크에 남은 여액과 물 세척액을 세척한다. 여과액과 물 세척액에 에탄올을 4배량 가하기 위한 방법으로 물을 첨가하여 여과액과 물 세척액의 무게를 80 g으로 맞추고, 60℃의 95% 에탄올 320 mL을 가할 수도 있다. 그 후, 상온에서 1시간 침전시킨 후, 7) 총 식이섬유 함량 측정 중 ☆이하에 따라 SDF의 함량을 측정한다.

5. (생  략)

3-17 ∼ 3-25 (현행과 같음)

3-26 식이섬유

3-26-1 식이섬유(제1법)

1. (현행과 같음)

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 비커 : --------------- --------

2.1.2 ∼ 2.1.12 (현행과 같음)

3. (현행과 같음)

4. 시험과정

4.1 시험용액의 조제

4.1.1 (현행과 같음)

4.1.2 효소분해

-------------------- ----------------비커- ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------비커---  --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------비커-----------------  --------------------------------비커-----  ------------------------------------------------------------------비커-----------  ---------------------------------------------------------비커  --------------------------비커----------- ------------------------------------------------------------------------------------------------------비커--------------- -----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------비커--------------  ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------.

4.2 총 식이섬유(TDF) 함량 측정

4.2.1 -------------------- -------------------------------------------------------------------------------------------------------- 비커------------  ----------------------------------------.  ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------비커----------------------------------------------------------------------------------------------------. --------------------------------------------------------------------------------.  ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------.

4.3 물불용성 식이섬유(IDF) 측정

4.3.1 ---------------------  ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------. --비커- --------------------- ---------------------------------------------------------------비커----------------- -----------------. --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------.

4.4 수용성 식이섬유(SDF) 측정

4.4.1 --------------------- ---------- 비커------ ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------.

5. (현행과 같음)

3-26-2 식이섬유(제2법)

1. (생  략)

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 (생  략)

2.1.2 비이커 : 500 mL Tall-form

2.1.3∼ 2.1.9 (생  략)

2.1.10 테프론 막대 : 비이커의 침전물을 모을 수 있는 것

2.1.11∼2.1.12 (생  략)

2.2 (생  략)

3. 표준물질 및 일반시약

3.1∼3.2 (생  략)

3.3 시액의 조제

3.3.1∼3.3.4 (생  략)

3.3.5 글리세롤 표준용액(10 mg/mL)

비이커에 글리세롤(순도 99.5% 이상) 10 g을 달아 1L 정용플라스크로 물로 씻어 옮겨 표선까지 채워 조제한다.

3.3.6 덱스트로즈-글리세롤 반응계수 확인용 표준용액(100 mg/mL)

비이커에 글리세롤(순도 99.5% 이상) 10 g을 달아 100 mL 정용플라스크에 물로 씻어 옮겨 표선까지 채워 조제한다.

4. 시험과정

4.1 (생  략)

4.2 효소분해

4개의 500 mL tall-form 비이커에 시료 1.000 ± 0.005 g을 정밀히 달아 2개의 검체(M1, M2)를 준비하고 2개의 공시험(B1, B2)을 준비한다. 이에  인산 완충용액 50 mL씩 가하고 초음파를 이용하여 시료가 뭉치지 않고 완벽하게 분산시킨다. 내열성 α-아밀라아제 용액 100 μL을 첨가한다. 비이커를 알루미늄박으로 덮은 후 95℃ 수욕에서 30분 동안 계속 진탕하면서 반응시킨다. 수욕의 온도가 95℃에 도달할 때부터 시작한다(보통 총 35분이면 충분하다). 수욕에서 모든 비이커를 꺼내어 실온으로 식힌다. 알루미늄박을 제거하고 비이커에 벽 또는 바닥에 생긴 겔 형태의 내용물을 시약스푼으로 긁어내어 용액 속에 분산시킨다. 비이커 벽과 시약스푼을 10 mL의 물로 씻어준다. 0.275 N 수산화나트륨용액으로 pH를 7.5±0.1로 조정한 후, 프로테아제 효소용액 0.5 mL를 각 비이커에 첨가한다. 알루미늄박으로 비이커를 덮고 60℃ 수욕에서 30분간 계속해서 교반하여 반응시킨다. 수욕의 온도가 60℃에 도달한 후 반응을 시작한다. 실온으로 용액을 식힌 후, 알루미늄박을 제거한 후 비이커를 잘 교반해주면서 0.325 N HCl로 용액의 pH를 4.5±0.2로 조정한다. 비이커를 교반해주면서 아미노글루코시다제 용액 0.3 mL를 첨가하고 알루미늄박으로 덮은 후 60℃ 수욕에서 지속적으로 흔들면서 30분간 항온한다. 수욕의 온도가 60℃에 도달할 때 반응을 시작한다.

4.3 (생  략)

4.3.1 60℃로 가열한 95% 에탄올을  60℃ 수욕 상의 효소 분해된 각각의 시험용액에 가한다. 이때 에탄올과 시험용액의 부피의 비율은 4 : 1이 되어야 한다. 수욕에서 비이커를 꺼내어 알루미늄박으로 덮고 실온에서 하룻밤 침전시킨다. 미리 규조토를 넣고 무게를 칭량한 유리여과기에 있는 78% 에탄올 15 mL을 가하여 규조토를 분산시킨 후 흡인 여과하여 규조토층이 고르게 형성되도록 한다. 에탄올 처리된 효소 분해물을 준비된 유리여과기로 여과하고 78% 에탄올이 들어있는 세척병과 고무재질의 시약 스푼을 이용하여 비이커의 잔류물을 유리여과기로 옮긴다. 이때 효소분해물에 엷은 막이 생성될 경우, 시약스푼으로 생성된 막을 깨고 여과한다. 진공을 유지하면서 20 mL 78% 에탄올 3회, 10 mL 95% 에탄올로 2회, 10 mL 아세톤으로 2회씩 잔류물을 씻어낸다. 105℃에서 잔류물이 남아있는 유리여과기를 하룻밤 건조시키고, 유리여과기를 데시케이터에서 1시간 동안 항량한 후, 식이섬유 잔류물 및 규조토를 포함한 유리여과기의 무게를 0.1 mg 단위까지 칭량한다. 미리 칭량하여 확인한 규조토를 포함한 유리여과기의 무게를 빼서 식이섬유의 무게를 계산한다. 같은 두개의 시료 중 하나는 1.1.3.1 총질소 및 조단백질에 따라 단백질 함량을 측정한다. 이때 질소계수는 6.25를 사용한다. 다른 하나는 1.1.2. 회분에 따라 회분량을 확인한다. 이때 525℃에서 5시간 이상 회화하고 0.1 mg 단위까지 칭량한다. 미리 칭량하여 확인한 규조토를 포함한 유리여과기의 무게를 빼서 회분의 무게를 결정한다.

4.4 (생  략)

5. (생  략)

3-26-2 식이섬유(제2법)

1. (현행과 같음)

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 (현행과 같음)

2.1.2 비커 : ---------------

2.1.3∼ 2.1.9 (현행과 같음)

2.1.10 ------------- : 비커- --------------------

2.1.11∼ 2.1.12 (현행과 같음)

2.2 (현행과 같음)

3. 표준물질 및 일반시약

3.1∼3.2 (현행과 같음)

3.3 시액의 조제

3.3.1∼3.3.4 (현행과 같음)

3.3.5 -------------------- 비커---------------- ----------------------------------------------------------------.

3.3.6 -------------------- --------------------------

------------------- -------------------------------------------------------------------.

4. 시험과정

4.1 (현행과 같음)

4.2 효소분해

---------------------비  커--------------------- ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------. 비커------------- ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------비커--------------------- -----------------------비커------------------- --------------------------------------------------------. 비커-------- ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------비커 -----------------------비커------------------- -----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------비커--------------- ------------------------------------------. 비커--------------------- ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------.

4.3 (현행과 같음)

4.3.1 -------------------- -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 비커-------------- ---------------. --- ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------.

4.4 (현행과 같음)

5. (현행과 같음)

3-27 ∼ 3-33 (생  략)

3-34 인지질 중 포스파티딜콜린의 함량

3-34-1 인지질 중 포스파티딜콜린의 함량(제1법)

1. (생  략)

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 ∼ 2.1.3 (생  략)

2.1.4 비이커

2.1.5 ∼ 2.1.6 (생  략)

3. (생  략)

4. 시험과정

4.1 ∼ 4.2 (생  략)

4.3 시험조작

4.3.1 ∼ 4.3.3 (생  략)

4.3.4 식힌 후 비이커 및 시계접시를 증류수로 씻어 여과한다.

4.3.5 ∼ 4.3.9 (생  략)

4.4 인지질 중 인의 정량

4.4.1 시험용액에서 100 μL를 원추형 비이커에 취하고 헥산을 제거한다.

4.4.2 (생 략)

5. 분석 및 계산(생  략)

3-27 ∼ 3-33 (현행과 같음)

3-34 인지질 중 포스파티딜콜린의 함량

3-34-1 인지질 중 포스파티딜콜린의 함량(제1법)

1. (현행과 같음)

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 ∼ 2.1.3 (현행과 같음)

2.1.4 비커

2.1.5 ∼ 2.1.6 (현행과 같음)

3. (현행과 같음)

4. 시험과정

4.1 ∼ 4.2 (현행과 같음)

4.3 시험조작

4.3.1 ∼ 4.3.3 (현행과 같음)

4.3.4 ---- 비커-----------  -------------------

-----.

4.3.5 ∼ 4.3.9 (현행과 같음)

4.4 인지질 중 인의 정량

4.4.1 -------------------비커에-------------  ----------.

4.4.2 (현행과 같음)

5. 분석 및 계산(현행과 같음)

3-34 인지질 중 포스파티딜콜린의 함량

3-34-2	인지질 중 포스파티딜콜린의 함량(제2법)

1. (생  략)

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 ∼ 2.1.3 (생  략)

2.1.4 비이커

2.1.5 원추형 비이커

2.2 (생  략)

3. (생  략)

4. 시험과정

4.1 ∼ 4.2 (생  략)

4.3 포스파티딜콜린 중 인의 정량

4.3.1 ∼ 4.3.3 (생  략)

4.3.4 식힌 후 비이커 및 시계접시를 증류수로 씻어 여과한다.

4.3.5 ∼ 4.3.6 (생  략)

4.4 인지질 중 인의 정량

4.4.1 시험용액에서 100 μL를 원추형 비이커에 취하고 헥산을 제거한다.

4.4.2 (생  략)

5. (생  략)

3-34 인지질 중 포스파티딜콜린의 함량

3-34-2 인지질 중 포스파티딜콜린의 함량(제2법)

1. (현행과 같음)

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 ∼ 2.1.3 (현행과 같음)

2.1.4 비커

2.1.5 ----- 비커

2.2 (현행과 같음)

3. (현행과 같음)

4. 시험과정

4.1 ∼ 4.2 (현행과 같음)

4.3 포스파티딜콜린 중 인의 정량

4.3.1 ∼ 4.3.3 (현행과 같음)

4.3.4 ---- 비커------------

---------------------

--------.

4.3.5 ∼ 4.3.6 (현행과 같음)

4.4 인지질 중 인의 정량

4.4.1 ------------------

--비커--------------

-----------.

4.4.2 (현행과 같음)

5. (현행과 같음)

3-35 콜레스테롤

1. ∼ 3. (생  략)

4. 시험과정

4.1 (생  략)

4.2 시험용액의 조제

4.2.1 (생  략)

4.2.2 추출

4.2.2.1 〜 4.2.2.4 (생  략)

4.2.2.5 유리솜과 약 20 g의 무수황산나트륨이 채워진 유리깔대기를 통해 수세한 톨루엔을 약 2 g 무수황산나트륨이 채워진 삼각플라스크로 흘려주어 탈수한다.

4.2.3 (생  략)

5. (생  략)

3-35 콜레스테롤

1. ∼ 3. (현행과 같음)

4. 시험과정

4.1 (현행과 같음)

4.2 시험용액의 조제

4.2.1 (현행과 같음)

4.2.2 추출

4.2.2.1 〜 4.2.2.4 (현행과 같음)

4.2.2.5 ------------------------------------ 유리깔때기를---- -----------------------------------------.

4.2.3 (현행과 같음)

5. (현행과 같음)

3-36 ∼ 3-37 (생  략)

3-38 식물스테롤

1. ∼ 3. (생  략)

4. 시험과정

4.1 (생  략)

4.2 시험용액의 제조

4.2.1 (생  략)

4.2.2 추출

4.2.2.1 〜 4.2.2.4 (생 략)

4.2.2.5 유리솜과 약 20 g의 무수황산나트륨이 채워진 유리깔대기를 통해 수세한 톨루엔 층을 약 2 g 무수황산나트륨이 채워진 삼각플라스크로 흘려주어 탈수한다.

4.2.2.6 〜 4.2.2.8 (생  략)

5. 분석 및 계산(생  략)

3-36 ∼ 3-37 (현행과 같음)

3-38 식물스테롤

1. ∼ 3. (현행과 같음)

4. 시험과정

4.1 (현행과 같음)

4.2 시험용액의 제조

4.2.1 (현행과 같음)

4.2.2 추출

4.2.2.1 〜 4.2.2.4 (현행과 같음)

4.2.2.5 -------------------  -------------------유리깔때기를---------------------------------------------- ---------------------------.

4.2.2.6 〜 4.2.2.8 (현행과 같음)

5. 분석 및 계산(현행과 같음)

3-39 ∼ 3-45 (생  략)

3-46 아스타잔틴

<신  설>

<신  설>

3-39 ∼ 3-45 (현행과 같음)

3-46 아스타잔틴

3-46-1 아스타잔틴(제1법)

(현행 3-46 시험법 내용과 같음)

3-46-2 아스타잔틴(제2법)

1. 시험방법의 요약

본 시험법은 시료 중 아스타잔틴을 아세톤으로 녹여 추출하고 cholesterol esterase를 넣어 아스타잔틴에 붙어있는 ester기를 분리시킨 후 정제하여 이동상으로 녹인 용액을 액체크로마토그래피/자외부흡광광도검출기 및 순상컬럼을 이용하여 분석하는 방법으로 최대 흡수파장인 474 nm에서 정량분석 한다.

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1.	갈색부피플라스크(100 mL)

2.1.2. 액체크로마토그래프용 유리병

2.1.3. 용매용 일회용 실린지

2.1.4. 여과용 멤브레인필터 및 디스크형 멤브레인 필터

2.1.5. 원심분리기

2.1.6. 원심분리관(50 mL)

2.1.7. 시험관(50 mL) (사용되는 초자는 갈색의 유리기구를 사용한다.)

2.1.8. 초음파진탕기

2.1.9. 수욕조

2.1.10. 질소농축기

2.1.11. 질소가스

2.2 분석장비

2.2.1.	자외분광광도계(UV/Visible  Spectrophotometer)

2.2.2. 고속액체크로마토그래피

2.2.3. 자외부흡광광도 검출기(UV Detector) 또는 포토다이 오드어레이 검출기(Photodiode array)

2.2.4. 칼럼오븐

2.2.5. Luna silica 칼럼(안지름 4.6 mm, 길이 150 mm, 충진 입자 크기 3μm) 또는 이와 동등한 것

2.3 분석장비의 준비

이동상인 헥산과 아세톤을 82 : 18로 분당 1.2 mL씩 충분한 시간동안 흘려 칼럼과 기기를 안정화 시킨다.

3. 표준물질 및 시약

3.1 표준물질

3.1.1. 아스타잔틴(Astaxanthin)

분자식 : C40H52O4, 분자량 : 596.84, CAS No. : 19044-06-5

3.2 일반시약

3.2.1. 헥산(Hexane)

3.2.2. 클로로포름(Chloroform)

3.2.3. 아세톤(Acetone)

3.2.4. 석유 에테르(Petroleum ether)

3.2.5. 50 mM Tris-HCl 완충액(pH 7.0)

3.2.6. 무수황산나트륨(Sodium sulfate Anhydrous)

3.2.7. Cholesterol esterase

4. 시험과정

4.1. Cholesterol esterase 용액의 조제(사용직전에 조제)

4.1.1. Cholesterol esterase가 4 unit/mL(1 unit : pH 7.0, 37℃에서 1분당 1 μmole 콜레스테롤을 만드는데 필요한 효소의 양)이 되도록 50 mM Tris-HCl 완충액(pH 7.0)에 용해시킨다.

4.2. 표준원액의 조제

4.2.1. 아스타잔틴 표준품 3 mg을 100 mL 갈색부피플라스크에 정밀히 취한다.

4.2.2. 클로로포름 10 mL을 넣고 녹인다.

4.2.3. 헥산으로 표선까지 맞춘다.

4.3. 표준용액 조제

4.3.1. 100 mL 갈색부피플라스크에 표준원액 5, 10, 15 mL을 정밀히 취한다.

4.3.2. 클로로포름 4 mL을 넣어 녹인다.

4.3.3. 헥산으로 표선까지 맞춘다.

4.3.4. 4.3.3용액의 헥산을 대조액으로 하여 474 nm에서 흡광도를 측정한다.

4.3.5. 4.3.3용액을 표준용액으로 하여 고속액체크로마토그래피로 분석한다.

4.4. 시험용액 조제

4.4.1. 시료(아스타잔틴으로서) 약 1.5 mg을 100 mL 갈색부피플라스크에 정밀히 취한다.

4.4.2. 아세톤 100 mL을 넣어 완전히 용해시킨 후 표선까지 맞춘다.

4.4.3. 4.4.2용액을 아세톤으로 5배 희석한 것을 시험용액으로 한다.

4.4.4. 원심분리관에 시험용액 3 mL, Cholesterol esterase 용액 3 mL을 넣는다.

4.4.5. 37℃ 수욕에서 45분 동안 계속 교반하면서 반응시킨다.

4.4.6.	효소 분해 후 무수황산나트륨 1 g과 석유에테르 4 mL을 첨가하여 30초간 혼합한다.

4.4.7. 3,000 rpm에서 3분간 원심분리하여 석유에테르층을 시험관에 옮긴다.

4.4.8. 물층에 석유에테르 4 mL을 가하여 1회 반복 추출하여 석유에테르층을 합한다.

4.4.9. 탈수된 석유에테르층을 질소가스를 이용하여 완전히 건조시킨 후, 이동상 3 mL을 넣고 용해시킨다.

4.4.10. 위 용액을 0.45 um 멤브레인 필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다.

5. 분석 및 계산

5.1 기기 분석

표 1. 고속액체크로마토그래피 조건(예)

항목	조건
주입량	20 μL
칼럼온도	25 ℃
이동상	헥산 : 아세톤 (82 : 18)
검출기 파장	474 nm
유속	1.2 mL/분

5.2 계산

5.2.1. 아스타잔틴 농도 (μg/mL) = (474 nm 흡광도 x 10,000) / 2,100

2,100 : 474 nm에서 1cm cuvette 의 1 % 아스타잔틴의 기준 흡광도값

5.2.2. 아스타잔틴 이성질체 용출 순서

trans 아스타잔틴, 9-cis 아스타잔틴, 13-cis 아스타잔틴 순으로 용출된다.

5.2.3. 총 피크면적 = Ptrans + (1.2 x P9-cis) + (1.6 x P13-cis)

Ptrans : trans 아스타잔틴의 피크면적

P9-cis : 9-cis 아스타잔틴의 피크면적

P13-cis : 13-cis 아스타잔틴의 피크면적

1.2 : 9-cis를 trans 아스타잔틴으로 전환계수

1.6 : 13-cis를 trans 아스타잔틴으로 전환계수

5.2.4. 아스타잔틴 함량 (%) = (C x a x b x 100) / (S x 1,000)

C : 시험용액중의 아스타잔틴 농도(μg/mL)

a : 시험용액의 전량(mL)

b : 희석배수

S : 시료 채취량(mg)

3-47 ∼ 3-52 (생  략)

3-53 코엔자임 Q10

1. 시험방법의 요약

본 시험법은 시료 중 코엔자임Q10을 에탄올 용액으로 추출하여 액체크로마로그래프/자외부흡광광도검출기를 이용하여 분석하는 방법으로 최대흡수파장인 275nm에서 정량분석 한다.

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 ∼ 2.1.3 (생  략)

2.1.4 부피플라스크(50 mL)

2.1.5 (생  략)

2.2 분석장비

2.2.1 ∼ 2.2.2 (생  략)

2.2.3 옥타데실실릴화한 칼럼(안지름 4.6mm, 길이 250mm,  충전제 Octadecyl silica) 또는 이와 동등한 것

2.3 분석장비의 준비

이동상은 메탄올과 에탄올 13:7로 혼합한 용액을 이용하여 분당 1.0 mL를 충분한 시간동안 흘려 안정화 시킨다.

3. 표준물질 및 일반시약

3.1 표준물질

3.1.1 코엔자임Q10(Coenzyme Q10, Ubiquinone, Ubidecarenone)

분자식 : C59H90O5, 분자량 : 863.37, CAS No. : 303-98-0

3.2 일반시약

3.2.1 에탄올(Ethanol)

3.2.2 메탄올(Methanol)

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

4. 시험과정

4.1 표준용액의 조제

4.1.1 코엔자임Q10 표준물질 50 mg을 정밀히 측정한다.

4.1.2 정밀히 측정한 표준물질을 50 mL 부피플라스크에 넣는다.

4.1.3 에탄올을 넣어 표선까지 맞춘다.

4.1.4 에탄올로 적당히 희석하여 표준용액으로 한다.

4.2 시험용액 제조

4.2.1 시료(코엔자임Q10으로서) 약 50 mg을 정밀히 측정한다.

4.2.2 정밀히 측정한 시료를 50 mL 부피플라스크에 넣는다.

4.2.3 여기에 에탄올을 20 mL를 넣고 조심스럽게 흔든다.

4.2.4 시료가 전부 용해될 때까지 초음파진탕기로 용해시킨다.

4.2.5 에탄올을 넣어 표선까지 맞춘다.

4.2.6 0.45 μm 멤브레인 필터로 여과한 용액을 시험용액으로 한다.

5. 분석 및 계산

5.1 기기분석

표 1. 고속액체크로마토그래프 조건(예)

항목	조건
주입량	20 μL
칼럼온도	35 ℃
이동상	메탄올:에탄올(13:7)
검출기 파장	275 nm
유속	1.3 mL/분

5.2 결과 분석

코엔자임Q10(mg/g)= A×(B/S)×P×(1/1,000)

A  : 시료의 농도(μg/mL)

B  : 시험용액의 전량(mL)

S  : 시료채취량(g)

P  : 표준품의 순도

3-47 ∼ 3-52 (현행과 같음)

3-53 코엔자임 Q10

1. 시험방법의 요약

--------------------------

----헥산·무수에탄올혼합액으로

--------------------------

--------------------------

--------------------280 nm

에서-------------.

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 ∼ 2.1.3 (현행과 같음)

2.1.4 부피플라스크

2.1.5 (현행과 같음)

2.2 분석장비

2.2.1 ∼ 2.2.2 (현행과 같음)

2.2.3 --------------------

---------길이 150 mm,

--------------------

--------------

2.3 분석장비의 준비

이동상을 이용하여 용매를 ---

-------------------------

-----------.

3. 표준물질 및 일반시약

3.1 표준물질

3.1.1 ---------------------

--------------------

----- : C59H90O4, -----      : -------, : ---------

3.2 일반시약

3.2.1 헥산(n-Hexane)

3.2.2 에탄올(Ethanol)

3.2.3	무수염화제이철(Ferric chloride, anhydrous)

3.2.4 아세토니트릴(Acetonitrile)

3.2.5 테트라하이드로퓨란(Tetrahydrofuran)

3.3 시액의 조제

3.3.1 1% 무수염화제이철용액

무수염화제이철 1 g에 에탄올을 가하여 100 mL로 한다.

4. 시험과정

4.1 표준용액 제조

4.1.1 --------------------

------------ 칭량하여 10 mL 부피플라스크에 넣어 헥산·무수에탄올혼합액(5 : 2)으로 용해한 후 표선까지 정용한다.

4.1.2 위의 표준원액을 헥산·무수에탄올혼합액(5 : 2)으로  적정농도로 단계별 희석한다.

4.1.3 4.1.2의 희석한 표준원액 10 mL를 취하여 1% 무수염화제이철용액 2.5 mL를 넣은 다음 무수에탄올로 정확하게 25 mL로 하여 표준용액으로 한다.

<삭  제>

4.2 시험용액 제조

4.2.1 시료 약 10 mg(코엔자임Q10으로서)을 정밀히 칭량하여 100 mL 부피플라스크에 넣는다.

4.2.2 헥산·무수에탄올혼합액(5 : 2)을 넣어 시료가 전부 용해될 때까지 초음파 진탕기로 용해시킨 후 표선까지 정용한다.

4.2.3 이 액 10 mL를 취하여 25 mL 부피플라스크에 넣는다.

4.2.4 여기에 1% 무수염화제이철용액 2.5 mL를 넣은 다음 무수에탄올을 넣어 25 mL가 되게 정용한다.

4.2.5 0.45 μm 멤브레인 필터로 여과한 용액을 시험용액으로 한다.

<삭  제>

5. 분석 및 계산

5.1 기기분석

표 1. 고속액체크로마토그래프 조건(예)

항목	조건
주입량	10 μL
칼럼온도	40 ℃
이동상	아세토니트릴:테트라하이드로퓨란:물(55 : 40 : 5)
검출기 파장	280 nm
유속	1.0 mL/분

5.2 계산

5.2.1 코엔자임Q10(mg/g) = C × a/S × P × 1/1,000

C : 시험용액 중의 코엔자임Q10 농도(μg/mL)

a : 시험용액의 전량(mL)

S : 시료 채취량(g)

P : 표준품의 순도

1/1,000 : 단위 환산 계수

3-54 (생  략)

3-55 진세노사이드

1. ∼ 3. (생  략)

4. 시험과정

4.1 (생  략)

4.2 시험용액의 조제

4.2.1 ∼ 4.2.3 (생  략)

<신  설>

5. (생  략)

3-54 (현행과 같음)

3-55 진세노사이드

1. ∼ 3. (현행과 같음)

4. 시험과정

4.1 (현행과 같음)

4.2 시험용액의 조제

4.2.1 ∼ 4.2.3. (현행과 같음)

4.2.4 젤리시료제품

4.2.4.1 시료 약 3～4 g을 분액여두에 취하고 n-Hexane 100 mL 및 70% 메탄올 100 mL를 가하여 3시간동안 진탕 추출한다.

4.2.4.2 층이 완전히 분리될 때까지 정치한 다음 하층을 환저플라스크에 취하여 수욕 중에서 감압농축하고 농축물을 증류수 10 mL에 용해한 후 여과(0.45 μm)하여 시험용액으로 한다.

5. (현행과 같음)

3-56 ∼ 3-57 (생  략)

3-58 유산간균 및 구균

1. 시험방법의 요약

본 시험법은 시료에 함유된 유산균을 BCP 첨가 평판 배지를 이용하여 배양하는 방법으로 배양 후 집락계산기로 정량한다.

2. 장비와 재료

2.1 (생  략)

3. 일반시약 및 일반시액

3.1 일반시약

3.1.1 에탄올(Ethanol)

3.2 시액 및 배지의 조제

3.2.1 BCP첨가 평판측정용 한천배지(Plate Count Agar with Brom Cresol Purple)

3.2.1.1 Yeast Extract 2.5 g, Peptone 5.0 g, Dextrose 1.0 g, Polysorbate 80(Tween 80) 1.0 g L-Cysteine 0.1 g, Agar 15.0 g(다만, 종균에 따라 적정 peptone을 사용하여야 함)을 증류수 1,000 mL에 녹여 pH 6.8～7.0으로 조정한 후 BCP(Brom cresol purple)을 0.004～0.006%가 되도록 가한다. 시판되는 BCP 첨가 평판측정용 한천배지를 사용해도 무관하다.

3.2.1.2 121℃에서 15분간 멸균한다.

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

4. 시험과정

4.1 시험용액의 조제

4.1.1 (생  략)

4.1.2 반유동상시료

4.1.2.1 (생  략)

4.1.2.2 그 일정량(10～25 mL)을 멸균용기에 취해 9배 양의 멸균생리식염수와 혼합한 것을 시험용액으로 한다.

4.1.3 고체시료

4.1.3.1 (생  략)

4.1.3.2 멸균생리식염수를 가해 균질기를 이용해서 가능한 한 저온으로 균질화한다.

4.1.3.3 여기에 멸균생리식염수를 가해서 일정량(100～250mL)으로 한 것을  시험용액으로 한다.

4.1.4 분말상시료

4.1.4.1 (생  략)

4.1.4.2 그 일정량(10 g)을 멸균용기에 취해 9배 양의 멸균생리식염수와 혼합한 것을 시험용액으로 한다.

4.1.5 캡슐제품류

4.1.5.1 (생  략)

4.1.5.2 9배 양의 멸균생리식염수를 가해 균질기와 스토마커 등을 이용하여 균질화한 것을 시험용액으로 한다.

4.1.6 시험용액조제 시 주의사항

4.1.6.1 위와 같이 조제된 시험원액에 대해서는 멸균생리식염수 9 mL에 시험원액 1 mL를 취하여 10배 희석액으로 만든다.

4.1.6.2 필요에 따라 102배, 103배, 104배… 희석액을 만들어 사용한다.

4.1.6.3 시험용액의 조제 시 시료를 용기 포장한 대로 채취할 때에는 그 외부를 물로 씻고 자연 건조시킨 다음 마개 및 그 하부 5～10 cm의 부근까지 70% 알콜 탈지면으로 닦고, 화염멸균한 후 냉각하고 멸균한 기구로 개봉, 또는 Tween 80과 같은 세균에 독성이 없는 계면활성제를 첨가하는 것이 좋다. 개관하여 2차 오염을 방지하여야 한다. 지방분이 많은 시료의 경우는 Tween 80과 같은 세균에 독성이 없는 계면활성제를 첨가하는 것이 좋다.

4.1.7 냉동제품

4.1.7.1 냉동상태의 시료를 포장된 상태 그대로 40℃이하에서 될 수 있는 대로 단시간에 녹여 용기, 포장의 표면을 70% 알코올 솜으로 잘 닦은 후 상기 5.1.1～5.1.5의 방법으로 시험용액을 조제한다.

<신  설>

4.2 시험의 조작

4.2.1 각 단계별 희석액 1 mL를 멸균 페트리접시 2매 이상씩에 무균적으로 취한다.

4.2.2 약 43～45℃로 유지한 BCP첨가 평판측정용배지 약 15 mL를 무균적으로 5.2.1에 분주한다.

4.2.3 페트리접시 뚜껑에 부착하지 않도록 주의하면서 조용히 회전하여 좌우로 기울이면서 시료와 배지를 잘 섞고 냉각 응고시킨다. 단, 시료를 취하여 배지를 가할 때까지의 시간은 20분 이상 경과하여서는 안 된다.

4.2.4 냉각 응고시킨 페트리접시는 거꾸로 하여 35～37℃에서 72±3시간 배양한다.

<신  설>

4.2.5 발생한 황색의 집락을 유산균의 집락으로 계측한다.

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

5. 분석 및 계산

5.1 계산

5.1.1 배양 후 즉시 집락 계산기를 사용하여 생성된 집락수를 계산한다. 단, 부득이할 경우에는 5℃에 보존시켜 24시간 이내에 산정한다.

5.1.2 집락수의 계산은 확산집락이 없고(전면의 1/2이하 일 때에는 지장이 없음) 1평판 당 30～300개의 집락을 생성한 평판을 택하여 집락수를 계산하는 것을 원칙으로 한다. 전 평판에 300개 이상 집락이 발생한 경우 300에 가까운 평판에 대하여 밀집평판 측정법에 따라 안지름 9 cm의 페트리접시인 경우에는 1 cm2내의 평균집락수에 65를 곱하여 그 평판의 집락수로 계산한다. 전 평판에 30개 이하의 집락만을 얻었을 경우에는 가장 희석배수가 얕은 것을 측정한다.

5.2 유산균수의 기재보고
시료 1 mL 중의 유산균수를 기재 또는 보고할 경우에 그것이 어떤 제한된 것에서 발육한 집락을 측정한 수치인 것을 명확히 하기 위하여 1평판에 있어서의 집락수는 상당 희석배수로 곱하고 1 mL 중(1 g 중)의 유산균수 몇 개라고 기재보고하며 동시에 배양온도를 기록한다. 숫자는 높은 단위로부터 3단계를 4사5입하여 유효숫자를 2단계로 끊어 이하를 0으로 한다.

5.3 균수 계산 (예)

유산균수 (개/g) = A×희석배수

A : plate 당 집락 수(개)

3-56 ∼ 3-57 (현행과 같음)

3-58 유산균수

1. 시험방법의 요약

--------------------------

------MRS 배지 또는 BL 배지를 사용하여 -------------

--유산균의 집락을 계수한다.

2. 기기와 재료

2.1  (현행과 같음)

3. 일반시약 및 일반시액

3.1 일반시약

3.1.1 에탄올(Ethanol)

3.2 시액 및 배지의 조제

3.2.1 멸균생리식염수(Saline)

3.2.1.1 Sodium Chloride 8.5 g에 증류수를 가하여 1,000 mL로 하고 121℃로 멸균한다.

<삭  제>

3.2.2 펩톤식염완충액(Buffered Peptone Water)

3.2.2.1 Peptone 10 g, Sodium Chloride 5 g, Disodium Phosphate 3.5 g, Mono-potassium Phosphate 1.5 g을 증류수 1,000 mL에 가하여 pH를 7.2±0.2로 조정한 후 121℃에서 15분간 고압 멸균한다.

3.2.3 MRS 배지

3.2.3.1 Enzyme Digest of Casein 10 g, Meat Extract 10 g, Yeast Extract 4 g, Glucose 20 g, Polysorbate 80(Tween 80), Triammonium Citrate 2 g, Sodium Acetate 5 g, Magnesium Sulfate 7H2O 0.2 g, Manganese Sulfate 4H2O 0.05 g, Dipotassium hydrogen Phosphate 2 g, Agar 15 g을 증류수 1,000 mL에 녹이고 pH를 5.7±0.1로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균한다.

3.2.4 BL 한천배지(BL Agar)

3.2.4.1 Beef Extract 3 g, Liver Extract 5 g, Yeast Extract 5 g, Proteose Peptone 10 g, Tryptone  5 g, Soypeptone 3 g, Soluble Starch 0.5 g, Glucose 10 g, Dipotassium Phosphate  1 g, Monopotassium Phosphate 1 g, Magnesium Sulfate 0.2g, Sodium Chloride 0.01g, Manganese Sulfate 0.00674 g, L-Cysteine‧HCl‧H2O 0.5 g, Ferrous Sulfate  0.01 g, Polysorbate 80(Tween 80)  1 g, Agar  15 g을 증류수 1,000 mL에 녹이고 pH를 7.2로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균하여, 50℃로 냉각 후 소, 말, 양 또는 사람의 탈섬유소 혈액을 5%가 되도록 첨가한다(BL 한천배지 사용도 무관함).

4. 시험과정

4.1 시험용액의 조제

4.1.1 (현행과 같음)

4.1.2 반유동상시료

4.1.2.1 (현행과 같음)

4.1.2.2 -------------------  -------------------------------희석액과 ------------------------------.

4.1.3 고체시료

4.1.3.1 (현행과 같음)

4.1.3.2 희석액을 가해 균질기를 이용해서 가능한 한 저온으로 균질화한다.

4.1.3.3 ---------- 희석액을

------------------

------------------

-------------.

4.1.4 분말상시료

4.1.4.1 (현행과 같음)

4.1.4.2 ------------------

-------------------

희석액과 -----------

-------------------

----.

4.1.5 캡슐제품류

4.1.5.1 (현행과 같음)

4.1.5.2 ---------- 희석액을------------------------------------------------------ --------.

<삭  제>

4.1.6 냉동제품

4.1.6.1 ------------------

------------------

------------------

------------------

------------------

------------------

4.1.1～4.1.5의 ------

--------------.

4.1.7 시험용액조제 시 주의사항

4.1.7.1 시험용액 제조 희석액은 멸균생리식염수 또는 펩톤식염완충액을 사용한다.

4.1.7.2 위와 같이 조제된 시험원액에 대해서는 희석액 9 mL에 시험원액 1 mL를 취하여 10배 희석액으로 만든다.

4.1.7.3 필요에 따라 100배, 1,000배 등 단계별 희석용액을 만들어 사용할 수 있다.

4.1.7.4 시험용액의 조제 시 시료를 용기 포장한 대로 채취할 때에는 그 외부를 물로 씻고 자연 건조시킨 다음 마개 및 그 하부 5～10 cm의 부근까지 70% 알코올 탈지면으로 닦고, 화염멸균한 후 냉각하고 멸균한 기구로 개봉 또는 개관하여 2차 오염을 방지하여야 한다. 지방분이 많은 시료의 경우는 Polysorbate 80(Tween 80)과 같은 세균에 독성이 없는 계면활성제를 첨가할 수 있다.

4.1.7.5 실험을 실시하기 직전에 잘 균질화 하고 검사시료에 따라 시험용액을 조제한다.

4.2 시험의 조작

4.2.1 유산균수 측정방법은 MRS 배지 또는 BL 한천배지를 사용하여 유산균의 집락을 계수한다.

4.2.2 시료 10∼25 g(mL)에 9배 희석액을 가하여 100∼250 mL이 되게 하고 균질화한다(10-1용액).

4.2.3 시험용액(10-1용액) 1 mL에 희석액을 가하여 10 mL이 되게 하여 10-2시험용액을 만든 후 동일하게 조작하여 희석한다.

4.2.4 BL 한천배지 시험 조작

4.2.4.1 각 희석 시험용액 0.1 mL씩을 BL 한천배지 2매 이상에 접종하며 멸균초자봉으로 도말한다. 시료가 접종된 페트리접시(Pretridish)는 35∼37℃에서 48∼72±3시간 혐기배양한다. 배양 후 생성된 집락수를 측정하고 희석배수를 곱하여 검사 시료 g당 균수를 산출한다(접종량도 희석배수에 고려해야 한다).

4.2.5 MRS 배지 시험 조작

4.2.5.1 각 단계별 희석액 1 mL씩을 멸균 페트리접시(Pretridish) 2매 이상씩에 무균적으로 취한다.

4.2.5.2 약 43～45℃로 유지한 MRS 배지 약 15 mL을 무균적으로 분주한다.

4.2.5.3 페트리접시(Pretridish) 뚜껑에 부착하지 않도록 주의하면서 조용히 회전하여 좌우로 기울이면서 시료와 배지를 잘 섞고 냉각 응고시킨다. 단, 시료를 취하여 배지를 가할 때까지의 시간은 20분 이상 경과하여서는 안 된다.

4.2.5.4 냉각 응고시킨 페트리접시(Pretridish)는 거꾸로 하여 35∼37℃에서 48∼72±3시간 배양한다.

4.2.5.5 배양 후 생성된 집락수를 측정한다.

4.2.6 집락수 산정

4.2.6.1 배양 후 즉시 생성된 집락수를 계산한다. 단, 부득이할 경우에는 5℃에 보존시켜 24시간 이내에 산정한다.

4.2.6.2 집락수의 계산은 확산집락이 없고(전면의 1/2이하 일 때에는 지장이 없음) 1평판 당 30∼300개의 집락을 생성한 평판을 택하여 집락수를 계산하는 것을 원칙으로 한다. 전 평판에 300개 이상 집락이 발생한 경우 300에 가까운 평판에 대하여 밀집평판 측정법에 따라 안지름 9 cm의 페트리접시(Pretridish)인 경우에는 1 cm2내의 평균집락수에 65를 곱하여 그 평판의 집락수로 계산한다. 전 평판에 30개 이하의 집락만을 얻었을 경우에는 가장 희석배수가 얕은 것을 측정한다.

4.2.7 유산균수의 기재보고

4.2.7.1 시료 1 mL 중의 유산균수를 기재 또는 보고할 경우에 그것이 어떤 제한된 것에서 발육한 집락을 측정한 수치인 것을 명확히 하기 위하여 1평판에 있어서의 집락수는 상당 희석배수로 곱하고 1 mL 중(1 g 중)의 유산균수 몇 개라고 기재보고하며 동시에 배양온도를 기록한다. 숫자는 높은 단위로부터 3단계를 반올림하여 유효숫자를 2단계로 끊어 이하를 0으로 한다.

<삭  제>

3-59 비피더스균(Bifidobacterium)

1. 시험방법의 요약

본 시험법은 시료에 함유된 유산균을 BL 배지를 이용하여 배양하는 방법으로 배양 후 집락계산기로 정량한다.

2. 장비와 재료

2.1 (생  략)

3. 일반시약 및 일반시액

3.1 일반시약

3.1.1 에탄올(Ethanol)

3.2 시액 및 배지의 조제

3.2.1 펩톤식염완충액(Buffered Peptone Water)

3.2.1.1 Peptone 10 g, Sodium Chloride 5 g, Disodium Phosphate 3.5 g, Mono-potassium Phosphate 1.5 g을 1 L 부피플라스크에 넣는다.

3.2.1.2 증류수에 가하여 1,000 mL로 하고 pH 7.2±0.2로 조정한다.

3.2.1.3	121℃에서15분간 고압 멸균한다.

3.2.2 BL 한천배지(BL Agar)

3.2.2.1 Beef Extract 3 g, Liver Extract 5 g, Yeast Extract 5 g, Proteose Peptone 10 g, Tryptone  5 g, Soypeptone 3 g, Soluble Starch 0.5 g, Glucose 10 g, Dipotassium Phosphate  1 g, Monopotassium Phosphate 1g, Magnesium Sulfate 0.2g, Sodium Chloride 0.01g, Manganese Sulfate 0.00674 g, L-Cysteine‧HCl‧H2O 0.5 g, Ferrous Sulfate  0.01 g, Polysorbate 80(Tween 80)  1 g, Agar  15 g을 1 L 부피플라스크에 넣는다. 시판용 BL 한천배지 사용도 무관하다.

3.2.2.2 증류수를 이용하여 1,000 mL로 하고, pH 7.2로 조정한다.

3.2.2.3 121℃에서 15분간 멸균하여, 50℃로 냉각시킨다.

3.2.2.4 소, 말, 양 또는 사람의 탈섬유소 혈액을 5% 되도록 첨가한다.

3.2.3 BS한천배지(유산균과 비피더스균의 혼합제품에 적용)

3.2.3.1 BL agar 1 L에 Sodium Propionate 15 g, Praomomycin Sulfate 50 mg, Neomycin 100 mg, Lithium Chloride 3 g을 첨가하여 조제한다.

3.2.2.3 121℃에서 15분간 멸균한다.

<신  설>

4. 시험과정

4.1 시험용액의 조제

4.1.1 (생  략)

4.1.2 반유동상시료

4.1.2.1 (생  략)

4.1.2.2 그 일정량(10～25 mL)을 멸균용기에 취해 9배 양의 멸균생리식염수와 혼합한 것을 시험용액으로 한다.

4.1.3 고체시료

4.1.3.1 (생  략)

4.1.3.2 멸균생리식염수를 가해 균질기를 이용해서 가능한 한 저온으로 균질화한다.

4.1.3.3 여기에 멸균생리식염수를 가해서 일정량(100～250 mL)으로 한 것을 시험용액으로 한다.

4.1.4 분말상시료

4.1.4.1 (생  략)

4.1.4.2 그 일정량(10 g)을 멸균용기에 취해 9배 양의 멸균생리식염수와 혼합한 것을 시험용액으로 한다.

4.1.5 (생  략)

4.1.6 시험용액 조제 시 주의사항

4.1.6.1 위와 같이 조제된 시험원액에 대해서는 멸균생리식염수 9 mL에 시험원액 1 mL를 취하여 10배 희석액으로 만든다.

4.1.6.2 필요에 따라 102배, 103배, 104배… 희석액을 만들어 사용한다.

4.1.6.3 시험용액의 조제 시 시료를 용기 포장한 대로 채취할 때에는 그 외부를 물로 씻고 자연건조시킨 다음 마개 및 그 하부 5～10 cm의 부근까지 70% 알콜탈지면으로 닦고, 화염멸균한 후 냉각하고 멸균한 기구로 개봉, 또는 개관하여 2차 오염을 방지하여야 한다. 지방분이 많은 시료의 경우는 Tween 80과 같은 세균에 독성이 없는 계면활성제를 첨가하는 것이 좋다.

4.1.7 냉동제품

4.1.7.1 냉동상태의 시료를 포장된 상태 그대로 40℃이하에서 될 수 있는 대로 단시간에 녹여 용기,   포장의 표면을 70% 알코올 솜으로 잘 닦은 후 상기 5.1.1～5.1.5의 방법으로 시험용액을 조제한다.

<신  설>

4.2 시험의 조작

4.2.1 시험용액 1 mL에 펩톤식염완충용액을 가하여 10 mL가 되게 한 다음 잘 혼합한다.

<신  설>

4.2.2 위의 검액(10-1용액) 1 mL에 희석액을 가하여 10 mL가 되게하고 10-2 검액을 만든 후, 동일하게 조작하여 10-3, 10-4～10-7 검액을 조제한다.

<신  설>

<신  설>

4.2.3 각 희석검액 0.1 mL씩을 각각 BL배지 (혹은 BS배지) 상에 접종하여 멸균 초자봉으로 도말(포)한다.

<신  설>

4.2.4 이때 대조시험으로 검액을 가하지 아니한 동일 희석액 0.1 mL을 배지에 가한 것을 대조로하여 페트리접시, 희석용액, 배지 및 조작이 무균적이었는지 여부를 확인한다.

<신  설>

4.2.5 배지를 혐기성 상자에 넣고 37℃, 48～72시간 배양한다. 배양 후 집락을 계수하고 희석배수(×10)을 곱하여 시료 mL당 생균수를 산출한다.

5. 분석 및 계산

5.1 배양 후 BL 한천평판상의 균의 성장

5.1.1. Bifidobacterium longum

유갈색～황갈색의 반구상   으로 융기된 중심부가 적   갈색인 직경 약 1.0～2.0    mm의 집락을 형성한다.

5.1.2 Bifidobacterium bifidum

유갈색～회색으로 융기된    중심부가 적갈색인 직경 0.5～1.5 mm정도의 원형집락을 형성한다.

5.1.3 Bifidobacterium breve

유백색～유갈색의 반구형으로   중심부가 융기된 직경 1.0～   2.0 mm의 원형 집락을 형성한다.

5.2 계산

5.2.1 배양 후 즉시 집락 계산기를 사용하여 생성된 집락수를 계산한다. 단, 부득이할 경우에는 5℃에 보존시켜 24시간 이내에 산정한다.

5.2.2 집락수의 계산은 확산집락이 없고(전면의 1/2이하 일 때에는 지장이 없음) 1평판 당 30～300개의 집락을 생성한 평판을 택하여 집락수를 계산하는 것을 원칙으로 한다. 전 평판에 300개 이상 집락이 발생한 경우 300에 가까운 평판에 대하여 밀집평판 측정법에 따라 안지름 9 cm의 페트리접시인 경우에는 1 cm2내의 평균 집락수에 65를 곱하여 그 평판의 집락수로 계산한다. 전 평판에 30개 이하의 집락만을 얻었을 경우에는 가장 희석배수가 얕은 것을 측정한다.

5.3 비피더스균수의 기재보고

시료 1 mL 중의 비피더스균수를 기재 또는 보고할 경우에 그것이 어떤 제한된 것에서 발육한 집락을 측정한 수치인 것을 명확히 하기 위하여 1평판에 있어서의 집락수는 상당 희석배수로 곱하고 1 mL 중(1 g 중)의 비피더스균수 몇 개라고 기재보고하며 동시에 배양온도를 기록한다. 숫자는 높은 단위로부터 3단계를 4사5입하여 유효숫자를 2단계로 끊어 이하를 0으로 한다.

5.4 계산

비피더스 (개/g) = A × 희석배수

A : plate 당 집락 수(개)

3-59 유산간·구균 및 비피더스균

1. 시험방법의 요약

본 시험법은 유산간·구균과 비피더스균을 구분하여 산정해야 하는 경우에 한하며, 유산간·구균은 BCP첨가 평판측정용배지를 사용하고 비피더스균은 TOS-MUP 배지를 사용한 시험방법에 따라  시험한 후 산출한다.

2. 기구와 재료

2.1 (현행과 같음)

3. 일반시약 및 일반시액

3.1 일반시약

3.1.1 ----------

3.2 시액 및 배지의 조제

3.2.1 멸균생리식염수(Saline)

3.2.1.1 Sodium Chloride 8.5 g에 증류수를 가하여 1,000 mL로 하고 121℃로 멸균한다.

<삭  제>

<삭  제>

3.2.2 펩톤식염완충액(Buffered Peptone Water)

3.2.2.1 Peptone 10 g, Sodium Chloride 5 g, Disodium Phosphate 3.5 g, Mono-potassium Phosphate 1.5 g을 증류수 1,000 mL에 가하여 pH를 7.2±0.2로 조정한 후 121℃에서 15분간 고압 멸균한다.

<삭  제>

<삭  제>

<삭  제>

3.2.3 BCP첨가 평판측정용 한천배지(Plate Count Agar with Brom Cresol Purple)

3.2.3.1 Yeast Extract 2.5 g, Peptone 5.0 g, Dextrose 1.0 g, Polysorbate 80(Tween 80) 1.0 g, L-Cysteine 0.1 g, Agar 15.0 g(다만, 종균에 따라 적정 peptone을 사용하여야 함)을 증류수 1,000 mL에 녹여 pH 6.8～7.0으로 조정한 후 BCP(Brom cresol purple)을 0.004∼0.006%가 되도록 가한다. 시판되는 BCP 첨가 평판측정용 한천배지를 사용해도 무관하다.

3.2.3.2 ------------------

----.

3.2.4 TOS-MUP 배지

3.2.4.1 Trypticase peptone 10 g, Yeast Extract 1 g, KH2PO4 3 g, K2HPO4 4.8 g, (NH4)2SO4 3 g, Magnesium Sulfate 7H2O 0.2 g, (R)-Cysteine-HCL·H2O 0.5 g, Sodium propionate 15 g, TOS(Galactooligosaccharide) 10 g, Agar 15 g를 증류수 950 mL에 녹이고 pH를 6.3±0.2로 조정한 후 115℃에서 15분간 멸균하여 50℃정도로 식힌 다음 MUP(mupirocin) supplement(1 mg/mL)를 주사필터(0.22 ㎛)한 후 50 mL을 위의 배지에 첨가한다.

4. 시험과정

4.1 시험용액의 조제

4.1.1 (현행과 같음)

4.1.2 반유동상시료

4.1.2.1 (현행과 같음)

4.1.2.2 --------------------

--------------------

희석액과 ------------

-------------------.

4.1.3 고체시료

4.1.3.1 (현행과 같음)

4.1.3.2 희석액을 가해 균질기를 이용해서 가능한 한 저온으로 균질화한다.

4.1.3.3 여기에 희석액을 가해서 일정량(100∼250 mL)으로 한 것을 시험용액으로 한다.

4.1.4 분말상시료

4.1.4.1 (현행과 같음)

4.1.4.2 -------------------

-------------------

희석액과 ------------

------------------.

4.1.5 (현행과 같음)

<삭  제>

4.1.6 냉동제품

4.1.6.1 -------------------

-------------------

-------------------

-------------------

-------------------

-------------------

---- 4.1.1∼4.1.5의 ---

------------------.

4.1.7 시험용액조제 시 주의사항

4.1.7.1 시험용액 제조 희석액은 멸균생리식염수 또는 펩톤식염완충액을 사용한다.

4.1.7.2 위와 같이 조제된 시험원액에 대해서는 희석액 9 mL에 시험원액 1 mL를 취하여 10배 희석액으로 만든다.

4.1.7.3 필요에 따라 100배, 1,000배 등 단계별 희석용액을 만들어 사용할 수 있다.

4.1.7.4 시험용액의 조제 시 시료를 용기 포장한 대로 채취할 때에는 그 외부를 물로 씻고 자연 건조시킨 다음 마개 및 그 하부 5∼10 cm의 부근까지 70% 알코올 탈지면으로 닦고, 화염멸균한 후 냉각하고 멸균한 기구로 개봉 또는 개관하여 2차 오염을 방지하여야 한다. 지방분이 많은 시료의 경우는 Polysorbate 80(Tween 80)과 같은 세균에 독성이 없는 계면활성제를 첨가할 수 있다.

4.1.7.5 실험을 실시하기 직전에 잘 균질화하고 검사시료에 따라 시험용액을 조제한다.

4.2 시험의 조작

4.2.1 BCP첨가 평판측정용 배지를 사용한 경우

4.2.1.1 3-58 유산균수 MRS 배지에 준하여 시험하고 35～37℃에서 48～72±3시간 호기 또는 혐기 배양한 후 발생한 황색의 집락을 유산균으로 계수한다.

4.2.2 TOS-MUP 배지를 사용한 경우

4.2.2.1 3-58 유산균수 MRS 배지에 시험하고, 35∼37℃에서 48∼72±3시간 혐기 배양한다.

4.2.2.2 모든 시험에서는 시험용액을 가하지 아니한 동일 희석액 0.1 mL을 대조시험액으로 하여 시험조작의 무균여부를 확인한다.

4.2.3 집락수의 산정

4.2.3.1 3-58 유산균수의 4.2.6 집락수 산정에 따라 산정한다.

4.2.4 유산균의 기재보고

4.2.4.1 3-58 유산균수의 4.2.7 유산균의 기재보고에 따라 산정한다.

<삭  제>

<삭  제>

3-60 ∼ 3-65 (생  략)

3-66 플라보놀 배당체

1. (생  략)

2. 장비와 재료

2.1 ∼ 2.2 (생  략)

<신  설>

3. ∼ 4. (생  략)

5. 분석 및 계산

5.1 기기분석

표 1. 고속액체크로마토그래피 조건(예)

항목	조건
주입량	20 μL
검출기 파장	(생 략)
컬럼온도	(생 략)
이동상	A : 메탄올, B : 0.85% 인산을 함유한 증류수
유속	(생 략)

표 2. 이동상 조건

시간(분)	이동상(%)
	A	B
0 4 30 32 32.1 40	30 30 5 5 30 30	70 70 95 95 70 70

5.2 (생  략)

3-60 ∼ 3-65 (현행과 같음)

3-66 플라보놀 배당체

1. (현행과 같음)

2. 장비와 재료

2.1 ∼ 2.2 (현행과 같음)

2.3 분석장비의 준비

이동상으로서 0.1% 인산을 함유한 아세토니트릴과 0.1% 인산용액을 40 : 60으로 혼합하여 분당 1.0 mL씩 흘려줌으로서 칼럼과 기기를 안정화 시킨다.

3. ∼ 4. (현행과 같음)

5. 분석 및 계산

5.1 기기분석

표 1. 고속액체크로마토그래프 조건(예)

항목	조건
주입량	10 μL
검출기 파장	(현행과 같음)
칼럼온도	(현행과 같음)
이동상	0.1% 인산을 함유한 아세토니트릴 : 0.1% 인산용액 = 40 : 60
유속	(현행과 같음)

<삭  제>

5.2  (현행과 같음)

신․구조문대비표