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제9. 3. 3.3 중 “1) ～ 5)”를 “3) ～ 7)”로 하고 1)과 2)를 다음과 같이 신설한다.
1) 미생물검사용 시료는 25 g(mL)을 대상으로 검사함을 원칙으로 하며, 시료량이 적을 경우나 필요에 따라서 10 g(mL) 또는 그 이하의 양으로 검사할 수도 있다.
2) 미생물 정성시험을 할 때 5개 시료에서 각각 채취한 25 g(mL)을 검사하거나 5개 시료에서 25 g(mL)씩 채취하여 섞은(pooling) 125 g(mL)을 검사할 수 있다.
제9. 3. 3.5. 3.5.1. 가의 1)∼3) 및 나의 1)을 다음과 같이 한다.
가. 표준평판법
1) 시험조작
3.3 제조법에 따른 시험용액 1 mL와 10배 단계 희석액 1 mL씩을 멸균 페트리접시 2매 이상씩에 무균적으로 취하여 약 43～45℃로 유지한 표준한천배지(배지 1) 약 15 mL를 무균적으로 분주하고 페트리접시 뚜껑에 부착하지 않도록 주의하면서 조용히 회전하여 좌우로 기울이면서 검체와 배지를 잘 혼합하여 응고시킨다.
확산집락의 발생을 억제하기 위하여 다시 표준한천배지 3～5 mL를 가하여 중첩시킨다. 이 경우 검체를 취하여 배지를 가할 때까지의 시간은 20분 이상 경과하여서는 아니 된다. 페트리접시는 거꾸로 하여 35±1℃에서 48±2시간(시료에 따라서 30±1℃ 또는 35±1℃에서 72±3시간) 배양한다. 집락수의 계산은 확산집락이 없고 1개의 평판 15∼300개의 집락을 생성한 평판을 택하여 집락수를 계산하는 것을 원칙으로 한다. 검액을 가하지 아니한 동일 희석액 1 mL를 대조시험액으로 하여 시험조작의 무균여부를 확인한다.
2) 집락수 산정
배양 후 즉시 집락 계산기를 사용하여 생성된 집락수를 계산한다. 부득이할 경우에는 5℃에 보존시켜 24시간 이내에 산정한다. 집락수의 계산은 확산집락이 없고(전면의 1/2이하 일 때에는 지장이 없음) 1개의 평판당 15∼300개의 집락을 생성한 평판을 택하여 집락수를 계산하는 것을 원칙으로 한다. 전 평판에 300개 이상 집락이 발생한 경우 300에 가까운 평판에 대하여 밀집평판 측정법에 따라 그 평판의 집락수로 계산한다. 전 평판에 30개 이하의 집락만을 얻었을 경우에는 가장 희석배수가 낮은 것을 측정한다.
3) 세균수의 기재보고
표준평판법에 있어서 검체 1 mL 중의 세균수를 기재 또는 보고할 경우에 그것이 어떤 제한된 것에서 발육한 집락을 측정한 수치인 것을 명확히 하기 위하여 1평판에 있어서의 집락수는 상당 희석배수로 곱하고 그 수치가 표준평판법에 있어서 1 mL 중(1 g 중)의 세균수 몇 개라고 기재보고하며 동시에 배양온도를 기록한다. 숫자는 높은 단위로부터 3단계에서 반올림하여 유효숫자를 2단계로 끊어 이하를 0으로 한다.
① 15 - 300CFU/ plate인 경우
= 537/0.022 = 24,409 = 24,000 ② 15 CFU / plate 이하인 경우
= 24/0.2 = 120 | ||||||||||||||||||||||||||||||
나. 건조필름법
1) 시험조작
3.3 제조법에 따른 시험용액 1 mL과 각 10배 단계 희석액 1 mL를 세균수 건조필름배지(배지 53 또는 69) 각 2매 이상씩 접종한 후 잘 흡수시키고 35±1℃에서 48±2시간 배양한 후 생성된 붉은 집락수를 계산하고 그 평균집락수에 희석배수를 곱하여 일반세균수로 한다. 균수 산출 및 기재보고는 3.5.1 일반세균수에 따라 한다.
제9. 3. 3.7. 3.7.2. 다를 다음과 같이 한다.
다. 건조필름법
3.3 제조법에 따른 시험용액 1 mL와 각 10배 단계 희석액 1 mL를 대장균군 건조필름배지Ⅰ(배지 54) 또는 대장균군 건조필름배지Ⅱ(배지 70)에 접종한 후, 35±1℃에서 24∼48시간 배양한다. 대장균군 건조필름배지Ⅰ에서는 붉은 집락 중 주위에 기포를 형성한 집락수를 계산하고, 대장균군 건조필름배지Ⅱ에서는 청색 및 청녹색의 집락수를 계산하여 그 평균집락수에 희석배수를 곱하여 대장균군 수를 산출한다. 균수 산출 및 기재보고는 3.5.1 일반세균수에 따라 한다.
제9. 3. 3.8. 3.8.2. 나를 다음과 같이 한다.
나. 건조필름법
3.3 제조법에 따른 시험용액 1 mL와 각 단계 희석액 1 mL를 대장균 건조필름배지Ⅰ(배지 55) 또는 대장균 건조필름배지Ⅱ(배지 71)에 접종한 후, 35±1℃에서 24∼48시간 배양한다.
. 대장균 건조필름배지Ⅰ에서는 푸른 집락 중 주위에 기포를 형성한 집락수를 계산하고, 대장균 건조필름배지Ⅱ에서는 남색 및 보라색의 집락수를 계산하여 그 평균집락수에 희석배수를 곱하여 대장균 수를 산출한다. 균수 산출 및 기재보고는 3.5.1 일반세균수에 따라 한다.
제9. 3. 3.11의 1) ∼ 3)을 다음과 같이 한다.살모넬라 배지
1) 증균배양
시료 25 mL(g)에 225 mL의 펩톤식염완충액(Buffered Peptone Water)를 첨가하여 36±1℃에서 18～24시간 배양한 후 이 배양액을 2종류의 증균배지, 즉 10 mL의 Tetrathionate 배지(배지 88)에 1 mL를 첨가함과 동시에 10 mL의 RV 배지(배지 57) 또는 RVS 배지(배지 89)에 0.1 mL를 첨가하여 각각 36±1℃(Tetrathionate 배지) 및 42±0.5℃(RV 배지 또는 RVS 배지)에서 20～24시간 동안 증균배양한다.
2) 분리배양
각각의 증균배양액을 XLD Agar(배지 58) 및 BG Sulfa 한천배지(배지 90)[Bismuth Sulfite 한천배지(배지 64), Desoxycholate Citrate 한천배지(배지 31), HE(Hektoen Enteric) 한천배지(배지 91), XLT4 한천배지(배지 92)]에 도말한 후 36±1℃에서 20～24시간 배양한다. 의심집락은 5개 이상 취하여 확인시험을 실시한다.
3) 확인시험
가) 생화학적 확인시험
의심스러운 집락에 대해 TSI Agar(배지 32) 또는 LIA 사면배지(배지 93)에 천자하여 37±1℃에서 20～24시간 배양한다. TSI 및 LIA 검사결과 살모넬라균으로 추정되는 균에 대해서는 그람음성의 간균임을 확인하고, Indol(-), MR(+), VP(-), Citrate(+), Urease(-), Lysine(+), KCN(-), malonate(-) 시험등의 생화학적 검사를 실시하여 살모넬라 양성유무를 판정한다.
나) 응집시험
균종 확인이 필요한 경우 살모넬라진단용 항혈청을 사용한 응집반응 결과에 따라 균종을 결정한다. 먼저 살모넬라 O혼합혈청 시험으로서 다가 O항혈청을 사용하여 슬라이드 응집반응검사를 실시한 후 살모넬라 O인자 혈청시험 즉 A, B, C, D, E군 등의 인자 항혈청으로 슬라이드 응집반응을 실시하여 O혈청형을 결정한다. H인자 혈청시험은 편모(H)항혈청 즉 a, b, c, d, e, h, g, k, l , r, y, 1.2, 1.3, 1.5, 1.6 등에 대해 시험관 응집반응을 실시하여 결정한다.
제9. 3. 3.4. 3.4.1의 88) 〜 92)를 다음과 같이 신설한다.
88) Tetrathionate 배지(Tetrathionate Broth)
(1) Tetrathionate broth base
Polypeptone5 g
Bile salts1 g
Calcium carbonate10 g
Sodium thiosulfate･5H2O30 g
Distilled water1 L
1,000 mL 멸균증류수에 배지성분을 부유시켜서 섞은후 끓인다(배지성분이 침전되어 있으면 녹지 않는다). 최종 pH가 8.4±0.2가 되도록 한 뒤 45℃이하로 식혀서 5 ～ 8℃에 보관한다.
(2) Iodine-potassium iodide (I-KI) solution
Potassium iodide5 g
Iodine, resublimed6 g
Distilled water, sterile20 mL
5 mL의 멸균증류수에 Potassium iodide를 용해시킨 뒤 iodine을 첨가하고 완전히 녹인 후 증류수를 가하여 20 mL로 한다.
(3) Brilliant green solution
Brilliant green dye, sterile0.1 g
Distilled water, sterile100 mL
사용하려고 하는 날, 20 mL의 I-KI 용액과 10 mL의 Brilliant green 용액을 Tetrathionate broth base에 첨가하고 서서히 교반하면서 배지침전물들을 재부유시킨 뒤 20×150 mm 또는 16×150 mm의 멸균된 시험관에 무균적으로 10 mL씩 분주한다. 배지에 I-KI와 dye 용액을 첨가한 뒤에는 가열해서는 안된다.
89) RVS 배지(Rappaport-Vassiliadis soya peptone Broth)
Soya peptone4.5 g
Sodium Chloride7.2 g
Potassium Dihydrogen Phosphate1.26 g
Di-Potassium Dihydrogen Phosphate0.18 g
DMagnesium Chloride, Anhydrous13.58 g
Malachite Green Oxalate0.036 g
위의 성분을 증류수 1,000 mL에 녹여 pH 5.6±0.2로 조정하고 잘 섞어 배지가 녹을 때까지 끓인 후 10 mL씩 분주하여 115℃에서 15분간 멸균한다.
90) BG Sulfa 한천배지(Brilliant Green Sulfa Agar)
Yeast extract3 g
Protease Peptone No.310 g
Lactose10 g
Saccharose10 g
Sodium Sulfapyridine1.0 g
Sodium chloride5.0 g
Agar20 g
Brilliant Green0.0125 g
Phenol Red0.08 g
위의 성분 59 g을 증류수 1,000 mL에 넣고 pH 6.9로 조정하고 분말이 완전히 용해 되도록 1분간 끓인다. 과도히 가열하면 선택성이 떨어지므로 주의한다. 고압증기 멸균하여 사용한다.
91) HE 한천배지(Hektoen Enteric Agar)
Peptone12 g
Yeast extract3 g
Bile salts No. 39 g
Lactose12 g
Sucrose12 g
Salicin2 g
NaCl5 g
Sodium thiosulfate5 g
Ferric ammonium citrate1.5 g
Bromthymol blue0.065 g
Acid fuchsin0.1 g
Agar14.0 g
Distilled water1 L
가끔 교반시키면서 약 1분동안 가열한 뒤 항온수조에서 냉각시킨다. 페트리접시(Petridish)에 20 mL씩 분주하고 뚜껑을 열고 2시간가량 굳힌다. 최종 pH는 7.6±0.2로 하고, 1일 이상 보관해서는 아니 된다.
92) XLT4 한천배지(XLT4 Agar)
Proteose Peptone No.31.6 g
Yeast Extract3.0 g
L-Lysine5.0 g
Xylose3.75 g
Lactose7.5 g
Saccharose7.5 g
Ferric Ammonium Citrate0.8 g
Sodium Thiosulfate6.8 g
Sodium Chloride5.0 g
Agar18.0 g
Phenol Red0.08 g
위의 성분 59 g을 증류수 1,000 mL에 넣고 여기에 4.6 mL XLT Agar supplement를 넣고 분말이 완전히 용해되도록 1분간 끓인다. 마지막 pH는 7.4±0.2로 맞추고 고압증기멸균은 하지 않는다.
93) LIA 사면배지(Lysine Iron Agar)
Peptone5.0 g
Yeast Extract3.0 g
Dextrose1.0 g
L-Lysine HCl10.0 g
Ferric Ammonium Citrate0.5 g
Sodium Thiosulfate0.04 g
Bromcresol Purple0.02 g
Agar15.0 g
위 성분을 증류수 1,000 mL에 녹인 후 pH 6.7±0.2로 조정하고 121℃, 12분간 멸균한다.
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